一种固定化微生物制剂及其对石油污染土壤修复的方法技术

本发明专利技术公开了一种固定化微生物制剂，其中，所述步骤为：A、菌株来源，B、载体制备，C、培养基制备，D、菌株培养，本发明专利技术能够通过高活性固定化微生物制剂，将有机物与微生物紧密结合修复石油烃污染土壤，能够大大提高土壤中微生物数量，提高微生物对土壤中碳的利用，促进烃类物质降解。

【技术实现步骤摘要】
一种固定化微生物制剂及其对石油污染土壤修复的方法
本专利技术属于微生物
，具体涉及一种固定化微生物制剂及其对石油污染土壤修复的方法。
技术介绍
当今社会，随着石油需求量的不断提高，石油行业的不断发展，其中土壤石油污染成为当今倍受关注的问题。所述石油主要是由正烷烃、环烷烃、支链烷烃和杂原子化合物等组成的复杂混合物。在油田开采、和贮藏、加工等过程中造成的石油污染现象尤为突出。目前油田的高含水开采方式使油田外排水增加，其中含有的难降解、脂溶性等有机污染物对作业区土壤造成严重污染。落地原油和含油污水是开采过程中的主要污染物，通过横向扩散和纵向迁移对土壤造成污染，破坏土壤原有的营养结构，致使土壤板结和盐碱化，孔隙度、通气性和持水能力降低，影响微生物的生存和植物生长。石油烃及其衍生物在环境中经过挥发、扩散、氧化和微生物降解等过程，其组成及含量发生变化。用土著微生物的降解作用去除土壤中石油烃类污染物是石油污染土壤修复的方式之一，通过微生物的新陈代谢作用对石油烃进行降解，使其转化为二氧化碳和水。正常条件下，自然土壤中微生物数量很大，而石油烃降解菌数量则较少，一旦土壤环境受到污染，土壤中具有石油烃降解功能的微生物进行繁殖且数量逐步增加，而非石油烃降解菌数量急剧减少。根据土壤的污染程度，可通过投加高效石油烃优势降解菌或刺激土壤中的土著微生物增长的方式降解土壤中的石油烃。土壤中石油烃含量较低时，通过生物刺激的方式可强化土著菌的优势，达到降解石油烃的目的。当土壤中石油烃含量较高时，土著微生物的降解作用受到抑制，降解过程缓慢，需要添加优势降解菌加快石油烃的利用效率。通过载体的固定化作用，使加入土壤中的降解菌抗逆性增强，经过生长和繁殖使其数量增加，进而提高石油烃的降解效率。现有土壤修复产品设计较为单一，缺乏菌种和基质之间共生协同作用，不利于微生物生长繁殖，从而不利于石油烃的降解。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种固定化微生物制剂，以解决上述的技术问题。为实现上述目的，本专利技术提供如下技术方案：一种固定化微生物制剂，其中，所述步骤为：A、菌株来源a1、菌株均为实验室筛选菌株，包括假单胞菌属、青霉属、曲霉属及芽孢杆菌属；B、载体制备：b1：以玉米秸秆为原材料，在500℃缺氧条件下裂解3h，即得生物炭，以生物炭为载体；C、培养基制备：c1、牛肉膏蛋白胨平板培养基制备：牛肉膏3g、蛋白胨10g、NaCl5g、琼脂20g、水1L，pH为7.0-7.2。；c2、高氏1号平板培养基制备：KNO31g、K2HPO40.5g、MgSO4·7H2O0.5g、NaCl0.5g、FeSO4·7H2O0.01g、20g、琼脂20g，pH为7.2-7.4；c3、PDA培养基制备：新鲜去皮马铃薯200g，切成小块，加水煮沸20-30分钟，将固体中的液体挤出，并加入葡萄糖20g，琼脂15g，然后用水定容至1L；c4、BHB培养基制备：0.2g/L的MgSO4·7H2O，0.02g/L的CaCl2，1.0g/L的KNO3，1.0g/L的K2HPO4·3H2O和0.02g/L的FeCl3；D、菌株培养：d1、对培养基进行镜检，分别按照假单胞菌属、青霉属、曲霉属及芽孢杆菌属的培养基进行种子液的培养；d2、发酵培养24h-36h，发酵结束后，即得到纯种发酵液；E、固定化微生物制剂制备：e1、假单胞菌属、青霉属、曲霉属、芽孢杆菌属按1：1：1：1的比例进行配比，并加入混合培养基中进行充分混合，使混合液的终浓度为1X108CFU/ml；e2、以生物炭为载体将上述菌悬液和载体按照体积质量比15:1的比例混合，置于30℃恒温振荡器中，培养3天；e3、配置2.5％的氯化钙溶液，加入到上述混合液中，钙化12h，即得到固定化微生物制剂。优选的，所述高氏1号平板培养基中加入重铬酸钾溶液，以抑制细菌、霉菌生长，每100ml的高氏1号平板培养基中加入3％的重铬酸钾溶液。优选的，所述BHB培养基染料为碘硝基四唑紫，称取碘硝基四唑紫3g，并用灭菌纯水定容至1L。优选的，所述d2中发酵培养条件为35℃，pH为6-8。优选的，所述细菌浓度检测均通过稀释涂布的方法进行检测。一种固定化微生物制剂对石油污染土壤修复的方法，其总，包括以下操作：f1、向石油污染土壤中按1％的比例添加固定化微生物制剂，并放入30℃培养箱内进行培养；f2、控制土壤混合物C/N/P比为100/15/2，定期搅拌并保持土壤混合物湿度为60％，处理60天。优选的，所述f2中，可通过NH4NO3和K2HPO的投加，对土壤混合物C/N/P比进行控制。优选的，所述石油污染土壤样品来自于受石油污染的土壤，其中总石油烃含量为8.5g/kg，石油污染土壤经过晾干，并过4mm筛筛分。本专利技术的技术效果和优点：该固定化微生物制剂及其对石油污染土壤修复的方法，能够通过高活性固定化微生物制剂，将有机物与微生物紧密结合修复石油烃污染土壤，能够大大提高土壤中微生物数量，提高微生物对土壤中碳的利用，促进烃类物质降解。附图说明图1为本专利技术土壤修复后生物数量整体上升趋势图；图2为本专利技术土壤修复过程中饱和烃降解率增幅趋势图。具体实施方式下面将结合本专利技术实施例中的附图1-2，对本专利技术实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本专利技术一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本专利技术中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本专利技术保护的范围。本专利技术提供了一种固定化微生物制剂，其中，所述步骤为：A、菌株来源a1、菌株均为实验室筛选菌株，菌株对石油烃均具有较好的降解效果，菌株包含假单胞菌属、青霉属、曲霉属及芽孢杆菌属。B、载体制备：b1：以玉米秸秆为原材料，在500℃缺氧条件下裂解3h，即得生物炭，以生物炭为载体。C、培养基制备：c1、牛肉膏蛋白胨平板培养基制备：牛肉膏3g、蛋白胨10g、NaCl5g、琼脂20g、水1L，pH为7.0-7.2。；c2、高氏1号平板培养基制备：KNO31g、K2HPO40.5g、MgSO4·7H2O0.5g、NaCl0.5g、FeSO4·7H2O0.01g、20g、琼脂20g，pH为7.2-7.4，加入重铬酸钾溶液，以抑制细菌、霉菌生长，每100ml的高氏1号平板培养基中加入3％的重铬酸钾溶液。c3、PDA培养基制备：新鲜去皮马铃薯200g，切成小块，加水煮沸20-30分钟，将固体中的液体挤出，并加入葡萄糖20g，琼脂15g，然后用水定容至1L；c4、BHB培养基制备：0.2g/L的MgSO4·7H2O，0.02g/L的CaCl2，1.0g/L的KNO3，1.0g/L的K2HPO4·3H2O和0.02g/L的FeCl3，染料为碘硝基四唑紫，称本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种固定化微生物制剂，其特征在于，所述步骤为：/nA、菌株来源/na1、菌株均为实验室筛选菌株，包括假单胞菌属、青霉属、曲霉属及芽孢杆菌属；/nB、载体制备：/nb1：以玉米秸秆为原材料，在500℃缺氧条件下裂解3h，即得生物炭，以生物炭为载体；/nC、培养基制备：/nc1、牛肉膏蛋白胨平板培养基制备：牛肉膏3g、蛋白胨10g、NaCl5g、琼脂20g、水1L，pH为7.0-7.2。；/nc2、高氏1号平板培养基制备：KNO31g、K2HPO4 0.5g、MgSO4·7H2O 0.5g、NaCl 0.5g、FeSO4·7H2O 0.01g、20g、琼脂20g，pH为7.2-7.4；/nc3、PDA培养基制备：新鲜去皮马铃薯200g，切成小块，加水煮沸20-30分钟，将固体中的液体挤出，并加入葡萄糖20g，琼脂15g，然后用水定容至1L；/nc4、BHB培养基制备：0.2g/L的MgSO4·7H2O，0.02g/L的CaCl2，1.0g/L的KNO

【技术特征摘要】
1.一种固定化微生物制剂，其特征在于，所述步骤为：
A、菌株来源
a1、菌株均为实验室筛选菌株，包括假单胞菌属、青霉属、曲霉属及芽孢杆菌属；
B、载体制备：
b1：以玉米秸秆为原材料，在500℃缺氧条件下裂解3h，即得生物炭，以生物炭为载体；
C、培养基制备：
c1、牛肉膏蛋白胨平板培养基制备：牛肉膏3g、蛋白胨10g、NaCl5g、琼脂20g、水1L，pH为7.0-7.2。；
c2、高氏1号平板培养基制备：KNO31g、K2HPO40.5g、MgSO4·7H2O0.5g、NaCl0.5g、FeSO4·7H2O0.01g、20g、琼脂20g，pH为7.2-7.4；
c3、PDA培养基制备：新鲜去皮马铃薯200g，切成小块，加水煮沸20-30分钟，将固体中的液体挤出，并加入葡萄糖20g，琼脂15g，然后用水定容至1L；
c4、BHB培养基制备：0.2g/L的MgSO4·7H2O，0.02g/L的CaCl2，1.0g/L的KNO3，1.0g/L的K2HPO4·3H2O和0.02g/L的FeCl3；
D、菌株培养：
d1、对培养基进行镜检，分别按照假单胞菌属、青霉属、曲霉属及芽孢杆菌属的培养基进行种子液的培养；
d2、发酵培养24h-36h，发酵结束后，即得到纯种发酵液；
E、固定化微生物制剂制备：
e1、假单胞菌属、青霉属、曲霉属、芽孢杆菌属按1：1：1：1的比例进行配比，并加入混合培养基中进行充分混合，使混合液的终浓度为1X108CFU/ml；
e2、以生物炭为载体将上述菌悬液和载体按照体积质量比15:1的比例混合，置于30℃恒温振荡器...

【专利技术属性】
技术研发人员：王凯，
申请(专利权)人：南京师盛生态环境研究院有限公司，
类型：发明
国别省市：江苏;32