一种丙环唑半抗原、完全抗原和其抗体及其制备和应用制造技术

本发明专利技术公开了一种丙环唑半抗原、完全抗原和其抗体及其制备和应用。本发明专利技术首先制备得到了一种丙环唑半抗原，应用该半抗原制备得到了丙环唑完全抗原和多克隆抗体，该抗体对丙环唑具有高灵敏度和高特异性的识别能力，半抑制浓度为4.23ng/mL，定量检测范围为0.29～61.83ng/mL，检测限为0.06ng/mL，对乙环唑、三唑醇和己唑醇等类似物交叉反应率均低于1％，为建立特异性丙环唑的免疫检测方法提供了核心原材料；此外，利用该多克隆抗体建立了检测丙环唑残留的酶联免疫试剂盒和胶体金试纸条，具有特异性高、灵敏度高、精确度高、准确度高等特点，能够特异性的检测样品中的丙环唑残留。

【技术实现步骤摘要】
一种丙环唑半抗原、完全抗原和其抗体及其制备和应用
本专利技术属于食品安全检测
更具体地，涉及一种丙环唑半抗原、完全抗原和其抗体及其制备和应用。
技术介绍
丙环唑是一种既有保护作用又有治疗作用的内吸性三唑类杀菌剂，可被根茎叶部吸收，并很快地在植物体内向上传导。其作用机理是影响甾醇的生物合成，使病原菌的细胞膜功能受到破坏，最终导致细胞死亡，从而起到杀菌、防病和治病的功效。经查询中国农药信息网，丙环唑在我国登记的作物主要有水稻、小麦、玉米、大豆、油菜、马铃薯、茭白、莲藕、枇杷、花生、苹果、香蕉、榛子和人参等。残效期在1个月左右，一般只对皮肤和眼有刺激作用，经口误服，可引起恶心、呕吐等。由于其毒负作用，国内国际上均对其残留限量做出了限定。目前欧盟等国家对不同作物中的丙环唑残留量做出了详细的限量，日本肯定列表中规定丙环唑在菜心、芥蓝和小白菜上的最大允许残留限量(MRL值)为0.05mg/kg。中国在GB2763-2016《食品安全国家标准食品中农药最大残留限量》中规定各类食品中最大允许残留限量(MRL值)为0.02mg/kg。因此，为了公众的健康，对食品中丙环唑残留量的检测是十分必要的。有关丙环唑在蔬菜、水果、粮食、食品中的残留分析方法国内外已有一些报道。目前，对于丙环唑残留的检测方法主要有高效液相色谱(HighPerformanceLiquidChromatography，HPLC)、气相色谱(GasChromatography，GC)、气相色谱-质谱联用(GasChromatography-MassSpectrometer，GC-MS)以及高效液相-质谱联用(HighPerformanceLiquidChromatography-MassSpectrometer，HPLC-MS)等方法。这些方法结果可靠，灵敏度高，已有相关的技术标准可供参考。但由于需要昂贵的仪器、专门的操作人员，以及样品前处理复杂、有机溶剂使用量大等，因此该方法一方面不能实现现场的快速检测；另一方面也很难在我国基层单位广泛推广。与仪器分析方法相比，免疫检测方法因其简便、经济、快速等优点而在农药残留检测领域中受到越来越多的关注。ELISA方法是常用的免疫检测方法，但是其却有操作步骤相对较多，检测时间较长，检测结果不够直观等缺陷。因而ELISA在丙环唑农药的快速检测上的应用受到很大的限制。胶体金试纸条无需专业操作人员及任何辅助类仪器，根据反应所显现的条带几分钟即可判定结果，不仅操作简便、快速，且结果直观准确、成本低。而在建立能够高效、特异性检测丙环唑的免疫学检测方法时，关键在于获得灵敏度高、特异性强的抗体，如公开号为CN106596953A的中国专利提供了一种检测丙环唑的时间分辨荧光免疫分析试剂盒，是在丙环唑结构上进行改造、修饰，来合成半抗原，偶联蛋白来免疫动物，但这样会破坏丙环唑的结构，导致很难产生针对丙环唑的特异性抗体。因此，迫切需要提供一种保留丙环唑整体结构并且能够产生针对丙环唑特异性高的抗体的半抗原和抗原，同时建立一种检测高效、灵敏、特异性强、能专一检测丙环唑的免疫学检测方法。
技术实现思路
本专利技术旨在提供一种新型丙环唑半抗原的合成及多克隆抗体的制备，利用得到的多克隆抗体开发一种检测丙环唑残留的酶联免疫试剂盒，以及制备一种检测丙环唑的胶体金快速检测试纸条。本专利技术制备的丙环唑半抗原，以一种与丙环唑高度相似的结构类似物作为出发点，在一端进行延长碳链，极大地保证整个结构的完整性；制得的丙环唑多克隆抗体灵敏度高，特异性好，为建立特异性丙环唑的免疫检测方法提供了核心原材料，且以胶体金标记高亲和力的丙环唑多克隆抗体为基础制备而成的胶体金试纸条，具有较宽的选择性和较高的敏感性，能够特异性的检测食品中的丙环唑残留。本专利技术的首要目的是提供一种丙环唑半抗原。本专利技术的另一目的是提供所述丙环唑半抗原的制备方法。本专利技术的另一目的是提供一种丙环唑完全抗原。本专利技术的另一目的是提供一种丙环唑多克隆抗体。本专利技术的再一目的是提供一种检测丙环唑的酶联免疫试剂盒。本专利技术的再一目的是提供一种丙环唑胶体金快速检测试纸条。本专利技术上述目的通过以下技术方案实现：本专利技术首先提供了一种丙环唑半抗原，所述丙环唑半抗原的结构式如式(I)所示：所述丙环唑半抗原采用系统命名法命名为：(4-((((2S，4R)-2-((1H-1,2,4-三唑-1-基)甲基)))-2-(2,4-二氯苯基)-1,3-二氧戊环-4-基)甲氧基)-4-氧代丁酸即：4-(((2S,4R)-2-((1H-1,2,4-triazol-1-yl)methyl)-2-(2,4-dichlorophenyl)-1,3-dioxolan-4-yl)methoxy)-4-oxobutanoicacid)。本专利技术还提供所述丙环唑半抗原BHC-HS的制备方法为：将丙环唑类似物溶解于无水二氯甲烷后，加入丁二酸酐和4-二甲氨基吡啶进行反应，反应产物经旋干后，加入乙酸乙酯和饱和食盐水萃取，酯层用无水硫酸钠干燥，最后浓缩后即得到丙环唑半抗原；所述丙环唑类似物的结构式为：本专利技术将丙环唑类似物分子上羟基与丁二酸酐进行反应引入游离羧基形成丙环唑半抗原，在丙环唑类似物一端进行延长碳链，极大地保证整个结构的完整性。优选地，所述丙环唑类似物和无水二氯甲烷的质量体积比为10～15mg：1mL。更优选地，所述丙环唑类似物和无水二氯甲烷的质量体积比为15mg：1mL。优选地，丁二酸酐和丙环唑类似物的质量比为2～5:1。更优选地，丁二酸酐和丙环唑类似物的质量比为2：1。所述薄层层析的展开剂为体积比为3：1的乙酸乙酯和石油醚。本专利技术还提供了一种丙环唑完全抗原，是采用活泼酯法将上述的丙环唑半抗原与载体蛋白偶联，透析得到。优选地，所述载体蛋白为牛血清蛋白(BSA)或钥孔血蓝蛋白(KLH)。制备得到的丙环唑完全抗原的结构式如下：本专利技术还提供了一种丙环唑多克隆抗体，该多克隆抗体是将上述丙环唑完全抗原乳化后，免疫新西兰大白兔，经分离纯化得到。作为一种优选地实施方式，丙环唑多克隆抗体的制备方法具体包括以下步骤：(1)用2只(雌、雄各一只)4周的新西兰大白兔进行免疫，每只完全抗原为半抗原-钥孔血蓝蛋白偶联物(BHC-HS-KLH)(1mg/mL)500μL，初次免疫时将半抗原-钥孔血蓝蛋白偶联物(BHC-HS-KLH)按体积比1:1与弗式完全佐剂乳化，免疫新西兰大白兔。之后将BHC-HS-KLH按体积比1:1与弗式不完全佐剂乳化，每隔三周进行一次加强免疫，共加强免疫三次；(2)第三次免疫后隔一周兔耳静脉取血，离心取上清，-20℃保存备用。本专利技术制备的丙环唑多克隆抗体对丙环唑原药的半抑制浓度为4.23ng/mL，定量检测范围为0.29～61.83ng/mL，检测限为0.06ng/mL，对乙环唑、三唑醇的交叉反应率均低于1％。因此由上述方法制备得到的丙环唑多克隆抗体也在本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种丙环唑半抗原，其特征在于，其结构式如式(I)所示：/n

【技术特征摘要】
1.一种丙环唑半抗原，其特征在于，其结构式如式(I)所示：





2.权利要求1所述丙环唑半抗原的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：将丙环唑类似物溶解于无水二氯甲烷后，加入丁二酸酐和4-二甲氨基吡啶进行反应，薄层层析硅胶板确认产物；反应产物经旋干后，加入乙酸乙酯和饱和食盐水萃取，酯层用无水硫酸钠干燥，最后浓缩后即得到丙环唑半抗原；所述丙环唑类似物的结构式为：





3.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，所述薄层层析的展开剂为体积比为3：1的乙酸乙酯和石油醚。


4.一种丙环唑完全抗原，其特征在于，是由权利要求1所述丙环唑半抗原经活泼酯法与载体蛋白偶联得到。


5.根据权利要求4所述丙环唑完全抗原，其特征在于，所述载体蛋白为牛血清蛋白或钥孔血蓝蛋白。


6.一种丙环唑多克隆抗体，其特征在于，是将权利要求4所述丙环唑完全抗原乳化后免疫新西兰大白兔得到。


7.一种检测丙环唑的酶联免疫试剂盒，其特征在于，包括有：包被有包被原的酶标板、丙环唑标准品溶液、丙环唑多克隆抗体、酶结合物浓缩...

【专利技术属性】
技术研发人员：沈兴，陈博，雷红涛，李向梅，陈佳虹，王锦，徐振林，杨金易，沈玉栋，孙远明，
申请(专利权)人：华南农业大学，
类型：发明
国别省市：广东;44