靶向GPC3的CAR及应用其的CAR-NK细胞制造技术

本发明专利技术提供一种GPC3靶向性嵌合抗原受体，包括依次串联的特异性识别GPC3的单链抗体、跨膜区结构域和胞内区结构域；所述嵌合抗原受体的全长氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示。本发明专利技术GPC3靶向性的嵌合抗原受体可以显著提高NK细胞对肝癌细胞的杀伤性，且转导率高。

【技术实现步骤摘要】
靶向GPC3的CAR及应用其的CAR-NK细胞
本专利技术属于细胞免疫治疗领域，具体地，涉及一种靶向GPC3的CAR及应用其的CAR-NK细胞。
技术介绍
肝细胞癌(Hepatocellularcarcinoma,HCC)是肝脏的原发性上皮性肿瘤，常与潜在的病毒性、代谢性、自身免疫性或酒精性慢性肝病相关。肝细胞癌是原发性肝癌的主要形式之一，占所有原发性肝癌的85-90％。肝细胞癌的治疗取决于疾病分期，通常分为非常早期、早期、中期、晚期和末期(终末)，并针对每个阶段进行适当的治疗。患有早期肝细胞癌(A期，无症状的早期肿瘤)的患者可以选择可能的治疗选择(肿瘤切除，移植或消融)。患有中期肝细胞癌的患者(B期，无症状的多结节性肝癌)一般使用化学栓塞(TACE)治疗。肝细胞癌晚期(C期，症状性肿瘤，血管浸润或肝外转移)者应使用索拉非尼治疗，那些先前具有索拉非尼耐受性的患者可以用雷戈非尼治疗。末期肝细胞癌患者(D期)仅能接受保守治疗。早期的肝细胞癌通过手术切除还具有治疗完全缓解的可能，但随着分期演进，肝细胞癌治疗后复发率和死亡率极高，因此亟待新的治疗手段。嵌合抗原受体(Chimericantigenreceptor,CAR)修饰的T细胞是最受关注的肿瘤免疫疗法之一，该技术通过在T细胞中转染嵌合抗原受体，使T细胞可以特异性靶向肿瘤表面抗原，同时胞内段结构域可以提供第一和第二信号活化T细胞，使其成为具有精确靶向性、并持续维持杀伤活性的新一代细胞治疗技术，在多种肿瘤中特别是血液系统肿瘤的治疗中表现出了极佳的疗效。2017年间FDA已批准了两个CAR-T细胞免疫疗法上市，分别为诺华的Kymriah(CTL019)治疗复发或难治性儿童和成人B细胞急性淋巴细胞白血病，Kite的Yescarta(KTE-C19)治疗成人复发或难治性B细胞淋巴瘤。这一成果，成为CAR-T细胞治疗进程中的里程碑。但与此同时，安全性也成为困扰CAR-T临床应用的一大难题:细胞因子风暴、脱靶效应、严重的过敏反应和神经毒性，以及病毒载体带来的安全隐患严重限制了CAR-T的进一步推广。相比于T细胞杀伤的模式，NK细胞的杀伤模式对抗体亲和力要求更低，抗体选择范围更大；且NK细胞几乎不引起移植物抗宿主病D，因为成熟NK在体内寿命相对T细胞要短得多(一般7-10天)，近年来己逐步考虑采用NK细胞作为CAR的载体细胞。对于原代NK细胞或者细胞系的改造，主要是借鉴在CAR-T上积累的经验，但也有研究团队针对NK细胞的特点进行设计改造。例如有的研究人员为了提高CAR-NK对肿瘤细胞的特异性识别效果，将胞外结构域设计为NK细胞表面活化性受体的配体。CAR分子由负责靶向识别抗原的胞外结构域(受体胞外段或者单链抗体结构域(scFv，SingleChainFragmentVariable))、提供伸展性的铰链区、跨膜区、胞内段联合共刺激分子组成。胞内信号转导域的结构可决定嵌合抗原受体修饰后的免疫细胞活化信号的强弱，从而影响其抗肿瘤的效果。随着研究进展，研究人员发现不同的胞内结构域具有不同的抗肿瘤特性，因此需要根据不同的肿瘤、不同的宿主细胞选择合适的CAR分子。而且，目前针对NK细胞CAR的结构改造尚缺乏研究。磷脂酰肌醇蛋白聚糖3(glypican-3，GPC3)是细胞膜表面的硫酸乙酰肝素糖蛋白(heparansulfateproteoglycan，HSPG)，其在肝癌组织中高表达(阳性率高达74.8％)，而在正常肝组织中几乎不表达，是一种较为理想的肿瘤治疗靶点。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种CAR(嵌合抗原受体)及应用其的CAR-NK细胞，以有效激活免疫功能细胞并使免疫功能细胞高效地杀灭肝癌细胞。根据本专利技术的一个方面，提供一种GPC3靶向性的嵌合抗原受体，其特征在于：包括依次串联的特异性识别GPC3的单链抗体、跨膜区结构域和胞内区结构域；所述嵌合抗原受体的全长氨基酸序列如SEQIDNO：1所示。目前临床中所使用的CAR-NK中的嵌合抗原受体结构主要沿用了CAR-T第二代和第三代的结构，虽然NK细胞的诸多生物学行为与T细胞类似，但也有其独特的信号转导模式，其中多种激活型受体可以通过多种途径活化NK细胞，且信号之间具有叠加效应。为了既可以提高CAR-NK细胞对于肝癌细胞的杀伤性，又尽可能地简化CAR的结构，提高转导率，经过不断地摸索试验，本专利技术筛选出由SEQIDNO：1所示的氨基酸序列构成的嵌合抗原受体。另外，NK细胞中，部分激活型受体的跨膜区具有重要功能。本专利技术的CAR富含带有正电荷的赖氨酸，可与胞浆区含ITAM基序且带有负电荷的DAP12(DNAX-activationprotein12，DNAX活化蛋白12)结合，进而介导下游信号转导。作为上述技术方案的进一步改进，所述嵌合抗原受体由SEQIDNo：2所示的核苷酸序列编码得到。另一方面，本专利技术提供了一种表达基因，用于表达GPC3靶向性的嵌合抗原受体，其特征在于，所述嵌合抗原受体的全长氨基酸序列如SEQIDNO：1所示。作为上述技术方案的进一步改进，所述表达基因为如SEQIDNo.2所示的核苷酸序列。另一方面，本专利技术提供了一种表达载体，所述表达载体中含有上述表达基因。作为上述技术方案的进一步改进，所述表达载体为含有所述表达基因的慢病毒。另一方面，本专利技术提供了一种基因工程改造的NK细胞，其特征在于：所述NK细胞表达特异性识别GPC3的如上所述的嵌合抗原受体。作为上述技术方案的进一步改进，所述NK细胞为NK-92细胞系。原代NK细胞存在转染效率低下，且体外扩增能力有限；肿瘤患者体内NK细胞常常功能受损，无法发挥足够的细胞毒活性；使用异体NK细胞则需要严格去除T细胞，防止GVHD(移植物抗宿主病)发生。NK-92拥有很多独特的优势，其可以大量扩增，且易于转染，很容易通过基因操作来构建稳定均一的CAR-NK；NK-92在体内寿命较短，易于控制输注剂量且可以反复输注可获得持续的抗肿瘤作用；NK-92缺乏KIR的表达，同种异体NK细胞疗法具有更广泛的抗瘤谱，因为它可以通过不匹配的KIR效应绕过自身MHC分子限制。另一方面，本专利技术提供了基因工程改造的NK细胞在制备抗肝癌药物中的应用。另一方面，本专利技术提供了一种基因工程载体，其特征在于，所述载体表达如上所述的嵌合抗原受体。作为上述技术方案的进一步改进，药物组合物还包括药学可接受的辅料。本专利技术提供的CAR对于GPC3具有特异性，其在NK细胞上表达之后所得到的CAR-NK细胞针对GPC3靶点具有特异识别性，该CAR-NK细胞可以靶向GPC3抗原从而治疗肝癌。该GPC3特异性的CAR-NK细胞对肝癌杀伤细胞因子释放量大，对GPC3高表达的肝癌细胞系的毒性大，可以高效的杀伤GPC3高表达肝癌细胞。而且，本专利技术的CAR-NK细胞的转染效率高。附图说明图1为常规的针对GPC3的嵌合抗原受体的序列结构示意图；图2为本专利技术构建的CAR1-GPC3-NK92本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种GPC3靶向性的嵌合抗原受体，其特征在于：/n包括依次串联的特异性识别GPC3的单链抗体、跨膜区结构域和胞内区结构域；/n所述嵌合抗原受体的全长氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示。/n

【技术特征摘要】
1.一种GPC3靶向性的嵌合抗原受体，其特征在于：
包括依次串联的特异性识别GPC3的单链抗体、跨膜区结构域和胞内区结构域；
所述嵌合抗原受体的全长氨基酸序列如SEQIDNO：1所示。


2.根据权利要求1所述的GPC3靶向性的嵌合抗原受体，其特征在于，所述嵌合抗原受体由SEQIDNo：2所示的核苷酸序列编码得到。


3.一种表达基因，用于表达GPC3靶向性的嵌合抗原受体，其特征在于，所述嵌合抗原受体的全长氨基酸序列如SEQIDNO：1所示。


4.根据权利要求3所述的表达基因，其特征在于，所述表达基因为如SEQIDNo.2所示的核苷酸序列。


5.一...

【专利技术属性】
技术研发人员：沈振波，
申请(专利权)人：汕头普罗凯融生物医药科技有限公司，
类型：发明
国别省市：广东;44