一种球孢白僵菌内共生萝卜植株的方法及其共生植株对小菜蛾的防御技术

本发明专利技术涉及一种球孢白僵菌内共生萝卜植株的方法及其共生植株对小菜蛾的防御。该方法包括：将萝卜种子进行表面消毒，消毒完毕后用无菌吸水纸吸干种子表面的水分，然后将种子倒入事先配好的装有

【技术实现步骤摘要】
一种球孢白僵菌内共生萝卜植株的方法及其共生植株对小菜蛾的防御
本专利技术涉及一种球孢白僵菌内共生萝卜植株的方法及其共生植株对小菜蛾的防御。
技术介绍
内生真菌是寄生于健康植物中且不引起侵染的一类真菌。内生真菌往往对其共生的寄主植物存在有利影响，不仅可以促进寄主植物的生长发育，还可增强寄主植株对害虫的抗性，间接对害虫产生抑制作用。昆虫病原真菌作为直接毒害害虫的病原性天敌，是防治害虫的重要生物资源。近年来一直有研究记录昆虫病原真菌具有植物内生性，能够在自然环境中或采用人工接种方式直接与植物产生营养关系，其中白僵菌是目前描述较多的可以定殖在多种植物内的昆虫病原真菌。白僵菌通过喷施、浸种、灌根等人为的接种手段，使其成为内生真菌持续的定殖在植物当中，不仅能够促进植物生长，还能提高植物抗性。目前，国外关于利用白僵菌作为植物内生真菌提高植物抗虫性的研究较为深入，但国内相关研究较少，并且国内外还没有关于白僵菌作为萝卜内生真菌的研究。
技术实现思路
有鉴于此，本专利技术的目的在于提供一种球孢白僵菌内共生萝卜植株的方法及其共生植株对小菜蛾的防御，利用球孢白僵菌孢子悬液浸种法处理萝卜种子，使其在萝卜中定殖，发现通过浸种法可以将B.bassiana有效地定殖到萝卜植株中。B.bassiana内共生萝卜后能抑制小菜蛾的取食和生长发育，在生物防治小菜蛾方面存在积极的意义，具有一定的应用前景，有利于综合评价球孢白僵菌作为萝卜内生真菌的多重价值，推动球孢白僵菌作为内生真菌进行生物防治的进程，从而产生更显著的经济、社会和生态效益。为实现上述目的本专利技术采用以下技术方案实现：一种球孢白僵菌内共生萝卜植株的方法，包括以下步骤：将萝卜种子进行表面消毒，消毒完毕后用无菌吸水纸吸干种子表面的水分，然后将种子倒入事先配好的装有球孢白僵菌孢子悬浮液的锥形瓶中浸种。所述表面消毒的方法为：用75%乙醇溶液浸泡3min，再使用1.5%次氯酸钠溶液浸泡3min，最后用无菌水清洗3次，每次10s。所述球孢白僵菌孢子悬浮液的浓度为1×108个／mL；所述悬浮液的溶剂为0.05%Tween-80溶液。所述浸种的条件为:温度25℃，转速110转/min，浸种12h。所述萝卜品名为南畔洲大萝卜。进一步地，将利用上述方法获得的萝卜植株应用于防御小菜蛾中。本专利技术与现有技术相比具有以下有益效果：为球孢白僵菌植物内生性研究提供了新的记录，发现通过浸种法可以将B.bassiana有效地定殖到萝卜植株中，且B.bassiana内共生萝卜后能抑制小菜蛾的取食和生长发育。附图说明图1：B.bassiana在萝卜叶、茎、根的定殖。图2：B.bassiana在萝卜中的定殖对萝卜株高的影响。图3：B.bassiana在萝卜中的定殖对萝卜叶长的影响。图4：B.bassiana在萝卜中的定殖对萝卜叶宽的影响。图5：B.bassiana在萝卜中的定殖对萝卜茎高的影响。图6：B.bassiana在萝卜中的定殖对萝卜根长的影响。图7：B.bassiana在萝卜中的定殖对萝卜干株重的影响。图8：B.bassiana在萝卜中的定殖对小菜蛾取食量的影响。图9：B.bassiana在萝卜中的定殖对小菜蛾四龄幼虫虫重和蛹重的影响。图10：B.bassiana在萝卜中的定殖对小菜蛾发育历期的影响；其中A为发育历期（卵期除外）；B为幼虫期；C为蛹期；D为成虫期。图11：B.bassiana在萝卜中的定殖对小菜蛾繁殖的影响；其中A为化蛹率；B为羽化率；C为单雌产卵量；D为卵孵化率。图12B.bassiana在萝卜中的定殖对小菜蛾死亡率的影响；其中A为幼虫死亡率；B为蛹死亡率。具体实施方式下面结合附图及实施例对本专利技术做进一步说明。实施例1本实施例提供一种球孢白僵菌内共生萝卜植株的方法及其共生植株对小菜蛾的防御。所述球孢白僵菌菌株是从中国林业微生物保藏管理中心获得，分离于光肩星天牛幼虫，后保存于北纳菌种保存中心，菌种保藏号为BNCC117565。所述小菜蛾为2004年于福建省福州市郊区新店（26.08°N，119.28°E）采集，并长期饲养保种于实验室人工气候室中。包括以下步骤：本专利技术采取盆栽种植。种植盆规格为20*10*8cm，每盆种100粒B.bassiana处理的种子共5盆，每个盆有单独的网笼；对照组采用相同的方法种植。实验设置3个生物学重复。实验处理分别为：将种子倒入事先装有球孢白僵菌孢子悬液的锥形瓶中，球孢白僵菌孢子悬浮液的浓度为1×108个／mL；所述悬浮液的溶剂为0.05%Tween-80溶液。对照组是将萝卜种子浸泡在加有0.05%Tween-80的无菌水浸种，将两组锥形瓶放入摇床中，设置温度25℃，转速110转/min，12h后取出。每天浇1次无菌水（时间要固定），使用的人工气候室要事先用紫外线消毒4h，种植温度25±2℃，湿度70±5%，光周期16L:8D。将随机选出的12粒种子进行表面消毒（此次表面消毒，75%乙醇浸泡和1.5%次氯酸钠溶液浸泡的时间为4min，最后用无菌水清洗3次，每次10s），消毒完毕后用无菌吸水纸吸干种子表面的水分。采用血球计数板计算悬浮液中孢子数，孢子悬液浓度为1×108个／mL，放在4℃保存，以备后用。土壤选用天然泥炭土，分装在锡纸盒中放入高压蒸汽灭菌锅，设定温度为121℃，时间为1h，随后在鼓风干燥箱中100℃烘干48h，使用前在无菌人工气候室冷却。实施例2参照附图1-12，本实施例提供了对实施例1效果的检测方法及结果。一、实验方法1.B.bassiana在萝卜中定殖情况的检测实施例1一周后，从每个盆中随机取出3株萝卜幼苗，用清水洗净，尽量减少对植株的损伤，用无菌手术刀将每株幼苗切成2片叶，2段茎，2段根，每株幼苗的叶茎根要分别进行表面消毒，表面消毒完成后晾干（用无菌的纸巾吸水以加速晾干的速度）并置于YPDA平板上，培养在人工培养箱，7天后观察。无菌水处理的种子用相同的方法检测。每周检测1次共检测4周，每盆设置3个生物学重复。四周后比较5个盆中B.bassiana的定殖情况，选出定殖率高的种植盆中的萝卜幼苗进行小菜蛾取食量和适合度的实验。定殖率（%）=定殖B.bassiana叶、茎、根的数量/叶、茎、根的总数。2.萝卜幼株内生B.bassiana的鉴定萝卜幼株中内生的真菌在第7天会长成3-4cm2大小的菌株，颜色呈白色或淡黄色，初步鉴定应为B.bassiana，用接种环或细竹签少量挑取内生B.bassiana的孢子、菌丝放在无菌载玻片上制成玻片，用CottonBlue染色后放在光学显微镜下观察。用无菌刀片在内生B.bassiana菌株上切下1cm2大小的菌块，提取DNA进行分子鉴定。测序结果用DNAMAN软件与B.bassiana母种的序列进行比对分析。接种B.bassiana的萝卜生长到第2本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种球孢白僵菌内共生萝卜植株的方法，其特征在于，包括以下步骤：将萝卜种子进行表面消毒，消毒完毕后用无菌吸水纸吸干种子表面的水分，然后将种子倒入事先配好的装有球孢白僵菌孢子悬浮液的锥形瓶中浸种。/n

【技术特征摘要】
1.一种球孢白僵菌内共生萝卜植株的方法，其特征在于，包括以下步骤：将萝卜种子进行表面消毒，消毒完毕后用无菌吸水纸吸干种子表面的水分，然后将种子倒入事先配好的装有球孢白僵菌孢子悬浮液的锥形瓶中浸种。


2.根据权利要求1所述的一种球孢白僵菌内共生萝卜植株的方法，其特征在于，所述表面消毒的方法为：用75%乙醇溶液浸泡3min，再使用1.5%次氯酸钠溶液浸泡3min，最后用无菌水清洗3次，每次10s。


3.根据权利要求1所述的一种球孢白僵菌内共生萝卜植株...

【专利技术属性】
技术研发人员：夏晓峰，艾欣，尤民生，林诗芬，
申请(专利权)人：福建农林大学，
类型：发明
国别省市：福建;35