一种评价化妆品和保健食品抗光老化、糖基化功效的方法技术

本发明专利技术涉及保健食品功效评价技术领域，尤其涉及一种评价化妆品和保健食品抗光老化、糖基化功效的方法，包括以下步骤：(1)选取斑马鱼，加入待测试样，UVB照射，建立试样组；(2)选取斑马鱼，UVB照射，建立模型对照组；(3)分析尾鳍面积(A)，评价皮肤损伤修复功效；(4)测定糖化血红蛋白含量，评价抗糖基化功效；(5)测定斑马鱼β‑半乳糖苷酶染色强度，评价β‑半乳糖苷酶抑制功效；(6)测定斑马鱼卵黄囊荧光强度，评价抗氧化功效；(7)测定斑马鱼20min内的总运动距离，评价运动改善功效。本发明专利技术实验周期短，检测抗糖基化功效的同时可展示皮肤损伤修复功效、β‑半乳糖苷酶抑制功效、抗氧化功效和运动能力改善功效。

【技术实现步骤摘要】
一种评价化妆品和保健食品抗光老化、糖基化功效的方法
本专利技术涉及保健食品功效评价
，尤其涉及一种评价化妆品和保健食品抗光老化、糖基化功效的方法。
技术介绍
在分子水平上老化的一个显著特征是经过非酶修饰的蛋白质的逐渐积累，其中最常见的是糖基化。还原糖与蛋白质(或其他分子)上的游离氨基发生反应，产生可逆的反应中间体，最终生成不可逆的晚期糖基化终产物(AGEs)。AGEs储存在组织中并与其受体连接，损伤组织功能。能够清除AGEs的物质提示具有抗老化作用。紫外线通常分为三类：UVA(400–315nm)，UVB(315–280nm)和UVC(280–100nm)。过去，化妆品抗光老化功效评价方法主要是UVA、UVB对脱毛大鼠进行照射，通过皮肤外观评价、皮损病理组织观察、生化检测氧化应激相关因子的变化。由于欧盟、英国、巴西、挪威、土耳其、韩国、印度、新西兰和以色列等国家和地区禁止用动物评价化妆品的功效，现有化妆品抗光老化、糖基化功效评价主要用体外的替代方法。1.人成纤维细胞抗老化实验：用UVA照射人原代成纤维细胞，检测细胞活性、β-半乳糖苷酶含量、氧自由基含量和总胶原蛋白含量。2.体外重建皮肤模型抗光老化实验：用UVB照射表皮模型，检测基质金属酶活性。3.AGEs清除实验：体外人血白蛋白与葡萄糖反应，检测荧光AGEs含量(《化妆品评价替代方法标准实施指南》)。现行的防晒功效评价方法，主要用人体评价防晒系数。临床研究发现正常老年人体内的糖化血红蛋白含量比正常年轻明显升高，而患有白内障的老年人(未患有糖尿病)体内的糖化血红蛋白含量比正常老年人明显升高。除单糖外，美拉德反应、糖的自氧化作用和其他代谢途径(如糖酵解)产生的二羰基化合物也会产生AGEs，这可以解释非糖尿病白内障患者血清AGEs的增加。由于体内不含任何能够降解AGEs的酶，所以糖化血红蛋白随着年龄的增长不断积累，即血清AGEs是与年龄呈线性关系。说明糖化血红蛋白不仅仅是长期血糖水平衡量的“金标准”，更是评价老化的指标之一。流行病学数据表明AGEs与正常血糖患者的慢性疾病风险存在正相关关系，如动脉粥样硬化、阿尔茨海默症、肾衰竭和皮肤老化(包括促进黑色素生成)。细胞实验显示：在紫外的照射下，血红蛋白发生过氧化形成高铁血红蛋白，这种反应也发生在皮肤。紫外辐射造成的红细胞损伤可能通过抑制膜结合ATP酶、乙酰胆碱酯酶(AchE)和G6PD、改变GSH含量和增强脂质过氧化作用破坏了负责维持细胞膜正常结构和功能的红细胞膜成分。有证据表明，氧化损伤和糖基化损伤呈正相关。紫外照射能诱发氧化损伤。AGEs通过产生涉及·O2-，H2O2和·OH的活性氧来促进皮肤光老化。AGEs的积累不但随着年龄的增长而增加，而且通过紫外线照射而被放大。现有抗光老测试均为体外方法，缺乏吸收、分布、代谢和排泄的过程，无法准确预测抗光老化的供试品在人体是否真正有效，也无法预测在体内代谢后代谢产品具有抗光老化功效的供试品。体外检测不具备可视化的优势，无法观察到在抗光老化、糖基化的同时皮肤损伤修复的变化，不利于化妆品和保健食品的宣传推广。可用于替代实验的光老化动物模型尚未建立。化妆品防晒功效评价方法主要用于化妆品，无法评价保健食品的抗光老化、糖基化功效。由于受精后5天(5dpf)内的斑马鱼幼鱼不需要进食，不属于动物，被欧盟认为在伦理学方面是可以接受，便被用于化妆品功效和安全性评价的替代实验。紫外照射能诱导斑马鱼氧自由基反应，但是否能诱导斑马鱼糖基化反应尚未见报道。我们迫切需要开发一种简便、快速检测的AGEs作为斑马鱼糖基化反应的指标。
技术实现思路
本专利技术为了克服上述现有技术中存在的问题，提供了一种实验周期短、检测抗糖基化功效的同时可展示皮肤损伤修复的效果的评价化妆品和保健食品抗光老化、糖基化功效的方法。为了实现上述目的，本专利技术采用以下技术方案：一种评价化妆品和保健食品抗光老化、糖基化功效的方法，包括以下步骤：(1)随机选取若干尾斑马鱼，加入待测试样，UVB照射，建立试样组；(2)随机选取与步骤(1)中数目相同的斑马鱼，UVB照射，建立模型对照组；(3)在解剖显微镜下，分别采集试样组和模型对照组中斑马鱼的尾鳍照片，用尼康NIS-ElementsD4.30.00高级图像处理软件分析尾鳍面积(A)，按照以下公式评价皮肤损伤修复功效：(4)分别采集试样组和模型对照组中的斑马鱼，用生理盐水制备成匀浆液，测定所述匀浆液的糖化血红蛋白OD值，根据糖化血红蛋白OD值换算糖化血红蛋白含量(H)，按照以下公式评价抗糖基化功效：(5)分别将试样组和模型对照组中的斑马鱼用4％多聚甲醛固定过夜，用β-半乳糖苷酶染色试剂盒进行染色，测定斑马鱼β-半乳糖苷酶染色强度(S，蓝色代表β-半乳糖苷酶的含量)，按照以下公式评价β半乳糖苷酶抑制功效：(6)分别将试样组和模型对照组中的斑马鱼用PBS洗脱，用避光染色，测定斑马鱼卵黄囊荧光强度(F，绿色荧光代表氧自由基含量)，按照以下公式评价抗氧化功效：(7)分别测定试样组和模型对照组中斑马鱼20min内的总运动距离(L)，按照以下公式评价运动改善功效：斑马鱼是脊椎动物，与人基因相似度高达87％。斑马鱼皮肤结构与功能与人类高度相似。含有基底层、棘层、颗粒层、透明层和表皮角质细胞层；另外尚有与人皮肤结构相同的固有层、半桥粒、黑色素细胞、血管和皮下脂肪细胞等。斑马鱼皮肤间质结缔组织、胶原及其临近的纤维母细胞及皮肤基因表达与人类皮肤相似。斑马鱼已获得广泛认可研究皮肤病变包括遗传病、色素异常、炎症、牛皮鲜、损伤修复、黑色素瘤等。因此，斑马鱼模型评价人用化妆品功效也具有较好的预测性。斑马鱼的消化系统由肝脏、胆囊和肠组成，肝和肠细胞的分化与人类高度保守；食欲调节(如血清素)和胰岛素调节功能保守；消化和营养物质的吸收以及运输与人类高度相似；拥有新陈代谢的关键器官(如下丘脑回路、胰腺和胰岛素反应组织，白色脂肪组织、肝脏和肌肉)。因此，斑马鱼服用保健食品后评价其功效，具有较高的预测性。本专利技术的检测原理为：UVB对斑马鱼的毒性要比对UVA的毒性大，LD50值之间的差异超过350倍。为了便于诱导损伤，选择UVB作为光源。(1)UVB照射后，鱼鳍会出现缺失和减小。(2)在皮肤老化的过程中，斑马鱼体内形成AGEs。糖化血红蛋白是AGEs的一种，不仅反应血糖的水平，也能反应光老化、糖基化的严重程度。将预先包被的糖化血红蛋白(HbA1c)抗体包被在微孔板中，依次加入斑马鱼匀浆上清液、标准品、HRP标记的检测抗体，经过温预并彻底洗涤。用底物TMB显色，TMB在过氧化物酶的催化下转化成蓝色，并在酸的作用下转化成最终的黄色。颜色的深浅和斑马鱼体内HbA1c呈正相关。(3)以X-Gal为底物，在衰老特异性β-半乳糖苷酶催化下细胞或组织会生成深蓝色产物。该染色仅染衰老细胞，不染衰老前、静止期细胞、永生细胞或肿瘤细胞。(4)绿色试剂是一种DNA染料，具有细胞通透性，原本无荧光或者在还原状态荧光非本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种评价化妆品和保健食品抗光老化、糖基化功效的方法，其特征在于，包括以下步骤：/n(1)随机选取若干尾斑马鱼，加入待测试样，UVB照射，建立试样组；/n(2)随机选取与步骤(1)中数目相同的斑马鱼，UVB照射，建立模型对照组；/n(3)分别采集试样组和模型对照组中斑马鱼的尾鳍照片，分析尾鳍面积(A)，按照以下公式评价皮肤损伤修复功效：/n

【技术特征摘要】
1.一种评价化妆品和保健食品抗光老化、糖基化功效的方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)随机选取若干尾斑马鱼，加入待测试样，UVB照射，建立试样组；
(2)随机选取与步骤(1)中数目相同的斑马鱼，UVB照射，建立模型对照组；
(3)分别采集试样组和模型对照组中斑马鱼的尾鳍照片，分析尾鳍面积(A)，按照以下公式评价皮肤损伤修复功效：



(4)分别采集试样组和模型对照组中的斑马鱼，用生理盐水制备成匀浆液，测定所述匀浆液的糖化血红蛋白OD值，根据糖化血红蛋白OD值换算糖化血红蛋白含量(H)，按照以下公式评价抗糖基化功效：



(5)分别将试样组和模型对照组中的斑马鱼用4％多聚甲醛固定过夜，用β-半乳糖苷酶染色试剂盒进行染色，测定斑马鱼β-半乳糖苷酶染色强度(S)，按照以下公式评价β半乳糖苷酶抑制功效：



(6)分别将试样组和模型对照组中的斑马鱼用避光染色，测定斑马鱼卵黄囊荧光强度(F)，按照以下公式评价抗氧化功效：



(7)分别测定试样组和模型对照组中斑马鱼20min内的总运动距离(L)，按照以下公式评价运动改善功效：





2.根据权利要求1所述的一种评价化妆品和保健食品抗光老化、糖基化功效的方法，其特征在于，步骤(1)中，所述待测试样为化妆品，所述斑马鱼为受精后2天的斑马鱼。


3.根据权利要求1所述的一种评价化妆品和保健食品抗光老化、糖基化功效的方法，其特征在于，步骤(1)中，所述待测试样为保健食品，所述斑马鱼为受精后3天的斑马鱼。


4.根据权利要求1所述的一种评价化妆品和保健食品抗光老化、糖基化功效的方法，其特征在于，步骤(4)中，所述匀浆液的糖化血红蛋白OD值的测定方法为：将所述匀浆液离心取上清液，加入到包被了HbA1c抗体的微孔板中，再加入辣根过氧化物酶标记的检测抗体100μL，37℃避光孵育1h...

【专利技术属性】
技术研发人员：徐懿乔，陈星辉，吴昱颖，朱晓宇，张勇，李春启，
申请(专利权)人：南京新环检测科技有限公司，
类型：发明
国别省市：江苏;32