【技术实现步骤摘要】
一种用于核酸快速检测的侧流层析-重组酶恒温扩增方法
本申请属于试剂盒
,具体为一种用于核酸快速检测的侧流层析-重组酶恒温扩增方法。
技术介绍
目前针对RNA病毒的较成熟的核酸检测技术主要有:实时荧光定量PCR、环介导等温扩增(LAMP)、依赖核酸序列扩增(NASBA)、重组酶聚合酶扩增技术(RMA)和基因芯片等。实时荧光定量PCR由于检测灵敏度高,适用范围广,操作简便等原因应用广泛,但其操作程序复杂、需要精密的仪器、检测时间较长,不利于非实验室环境下现场检测以及基层实验室的推广应用。基因芯片可以一次分析大量样品,但容易出现假阳性,重复性差,且技术成本昂贵、复杂。核酸恒温扩增技术由于其具备敏感、特异、快速、简便,不需要昂贵仪器设备等特点,已经在多个领域开展应用。但LAMP需要4-6条引物,设计复杂;NASBA方法容易出现假阴性或假阳性结果。另外,LAMP和NASBA反应时间至少需要60min。重组酶介导扩增(RMA)技术是一种核酸等温扩增技术,主要依赖重组酶、单链DNA结合蛋白(SSB)和链置换DNA聚合酶三种酶。其原理是重组酶与引物结合形成复合体,并在双链DNA中识别同源序列;然后重组酶解开双链,引物与同源序列发生链交换反应并启动DNA合成,对模板进行指数式扩增;被替换的DNA链与SSB结合,防止进一步替换。RMA反应最适温度在37~42℃,整个过程在10-30min内即可完成,30min内就可以将靶序列扩增到10~12数量级,可实现核酸的快速检测。RMA技术可以与侧向流动免疫层析技术(LFD) ...
【技术保护点】
1.一种用于核酸快速检测的侧流层析-重组酶恒温扩增方法,其特征在于,步骤如下:(1)提取待检测样本的总RNA,通过反转录获得cDNA;(2)设计用于核酸检测的引物和探针;(3)将反转录得到的cDNA中加入扩增反应试剂进行RMA扩增反应,扩增条件为:37-42℃水浴5min后,混匀,再37-42℃水浴15min;(4)应用侧流层析试纸条进行扩增产物的检测:对于阳性样品,扩增产物由于毛细管作用力从样品垫侧流至结合垫,其上的生物素与结合垫上的链霉亲和素特异性结合,复合物又侧流至T线后,扩增产物上的荧光素与T线上的荧光素抗体特异性结合,结合垫上过量的链霉亲和素又与C线上的生物素特异性结合,又因结合垫上链霉亲和素被胶体金标记,所以T线与C线同时显色;对于阴性样品,结合垫上的链霉亲和素与C线上的生物素特异性结合,所以只有C线显色。/n
【技术特征摘要】 【专利技术属性】
1.一种用于核酸快速检测的侧流层析-重组酶恒温扩增方法,其特征在于,步骤如下:(1)提取待检测样本的总RNA,通过反转录获得cDNA;(2)设计用于核酸检测的引物和探针;(3)将反转录得到的cDNA中加入扩增反应试剂进行RMA扩增反应,扩增条件为:37-42℃水浴5min后,混匀,再37-42℃水浴15min;(4)应用侧流层析试纸条进行扩增产物的检测:对于阳性样品,扩增产物由于毛细管作用力从样品垫侧流至结合垫,其上的生物素与结合垫上的链霉亲和素特异性结合,复合物又侧流至T线后,扩增产物上的荧光素与T线上的荧光素抗体特异性结合,结合垫上过量的链霉亲和素又与C线上的生物素特异性结合,又因结合垫上链霉亲和素被胶体金标记,所以T线与C线同时显色;对于阴性样品,结合垫上的链霉亲和素与C线上的生物素特异性结合,所以只有C线显色。
2.如权利要求1所述的一种用于核酸快速检测的侧流层析-重组酶恒温扩增方法,其特征在于,所述步骤(2)中所述核酸的引物长度一般为30-35bp,GC含量占40-60%,5’端的3-5个核苷酸不可多于两个G,3’端应有G和C且连续的三个核苷酸不可相同;核酸探针长度为46-52个核苷酸,探针5’端标记FAM基团,中间THF(dSpacer)替代G或C,dSpacer修饰距5’端28-32个碱基,距3’端13-17个碱基,3’端用C3-spacer修饰抑制DNA链的延伸。
3.如权利要求1所述的一种用于核酸快速检测的侧流层析-重组酶恒温扩增方法,其特征在于,所述水浴的温度为38℃。
4.如权利要求1所述的一种用于核酸快速检测的侧流层析-重组酶恒温扩增方法,其特征在于,所述步骤(4)中所述的侧向流层析试纸条包括支撑板、样品垫、结合垫、层析膜和吸水垫。
技术研发人员:陈大为,陈龙,李佳慧,张瑶,孙玉凤,
申请(专利权)人:济南国益生物科技有限公司,
类型:发明
国别省市:山东;37
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