一种基于G四链体分子信标双酶级联等温扩增的检测目的miRNA的方法技术

本发明专利技术公开了一种基于G四链体分子信标双酶级联等温扩增的检测目的miRNA的方法。该方法包括如下步骤：取含有miRNA、反应缓冲液、Bsu DNA聚合酶、Lambda核酸外切酶和G4MB的反应体系，孵育；检测荧光强度；根据荧光强度判断miRNA中是否含有目的miRNA或目的miRNA的含量。G4MB从5’末端至3’末端依次包括DNA片段1、DNA片段2和DNA片段3；DNA片段2的核苷酸序列与目的miRNA的核苷酸序列反向互补；G4MB的一端修饰荧光标记和磷酸基团，另一端修饰猝灭基团。实验证明，本发明专利技术提供的方法可以同时检测多种目的miRNA，且准确率高、灵敏度高且特异性好。本发明专利技术具有重要的应用价值。

【技术实现步骤摘要】
一种基于G四链体分子信标双酶级联等温扩增的检测目的miRNA的方法
本专利技术属于生物医学领域，具体涉及一种基于G四链体分子信标双酶级联等温扩增的检测目的miRNA的方法。
技术介绍
microRNAs(miRNA)是一类短的非编码RNA(约18-23nt)，在肿瘤的诊断、治疗和预后检测中发挥着重要的作用。miRNA是基因表达的转录后调节因子，调控约30％的已知蛋白编码基因的表达，在细胞增殖、迁移和凋亡等许多基本的细胞过程中发挥关键作用。成熟的miRNA存在于血清、粪便等各种体液中。临床证据表明，miRNA表达含量的异常往往与癌症的发病、癌细胞的侵袭、病灶的转移等有关，例如，miR-21(miR-21-5p)、miR-92a(miR-92a-3p)、miR-31(miR-31-5p)等致癌miRNA经常在结直肠癌发病过程中表现为上调，已被初步用于结直肠癌的早期检测。早期患者血液中的miRNA的浓度极低，同时miRNA具有体积小、家族成员间序列同源性高、总RNA样本丰度低、易降解等特点，因而很难准确地检测miRNA，阻碍其在临床检本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种检测目的miRNA的方法，包括如下步骤：/n(1)取含有miRNA、反应缓冲液、DNA聚合酶、核酸外切酶和G4MB的反应体系，孵育；/n(2)完成步骤(1)后，检测荧光强度；/n根据荧光强度判断miRNA中是否含有目的miRNA或目的miRNA的含量；/nG4MB从5’末端至3’末端依次包括DNA片段1、DNA片段2和DNA片段3；/nDNA片段1由1个5’端磷酸化并修饰荧光基团的dT和富G序列组成；/nDNA片段2的核苷酸序列与miRNA的核苷酸序列反向互补；/nDNA片段3由1个3’端修饰淬灭基团的dA和富G序列组成；/nDNA片段1和DNA片段3由于都存在富G序列在分子内形成绑定...

【技术特征摘要】
1.一种检测目的miRNA的方法，包括如下步骤：
(1)取含有miRNA、反应缓冲液、DNA聚合酶、核酸外切酶和G4MB的反应体系，孵育；
(2)完成步骤(1)后，检测荧光强度；
根据荧光强度判断miRNA中是否含有目的miRNA或目的miRNA的含量；
G4MB从5’末端至3’末端依次包括DNA片段1、DNA片段2和DNA片段3；
DNA片段1由1个5’端磷酸化并修饰荧光基团的dT和富G序列组成；
DNA片段2的核苷酸序列与miRNA的核苷酸序列反向互补；
DNA片段3由1个3’端修饰淬灭基团的dA和富G序列组成；
DNA片段1和DNA片段3由于都存在富G序列在分子内形成绑定的G四链体结构；
所述DNA聚合酶作用于与G4MB的3’末端结合的引物，将引物进行延伸，形成双链DNA；
所述核酸外切酶作用于双链DNA，逐步切去单核苷酸，且不能从DNA的切刻或缺口处起始消化。


2.如权利要求1所述的方法，其特征在于：所述反应体系还含有核糖核酸酶抑制剂。


3.如权利要求1所述的方法，其特征在于：
所述DNA聚合酶为BsuDNA聚合酶；
所述核酸外切酶Lambda核酸外切酶；
所述反应缓冲液为含40-60mMNaCl、15-25mMMgCl2、15-25mMKCl、130-170mMNH4Cl和0.8-1.2mMDDT的pH7.8-8.0、15-25mMTris-HCl缓冲液。


4.如权利要求1所述的方法，其特征在于：所述反应体系由浓度为80-120nM的G4MB、浓度为20-30ng/100uL的miRNA、4-6U/100uLBsuDNA聚合酶、8-12U/100uLLambda核酸外切酶、35-45U/100uL核糖核酸酶抑制剂和反应缓冲液组成。


5.如权利要求1所述的方法，其特征在于：所述步骤(1)中，孵育为35-39℃孵育20min-3h。


6.如权利要求1至5任一...

【专利技术属性】
技术研发人员：蒋宇扬，谭英，陈俊粤，谭春燕，
申请(专利权)人：清华大学深圳国际研究生院，
类型：发明
国别省市：广东;44