新载体及其应用制造技术

本文提供一种哺乳动物细胞用表达载体，其使哺乳动物细胞宿主具有高水平生产来自外源基因的蛋白质的能力。通过在具有二氢叶酸还原酶基因缺陷宿主细胞染色体上的转录热点引入质粒DNA、能够在不含次黄嘌呤‑胸苷(下文中记作HT)培养基中作为生长株被选择的结构的表达载体中导入遍在染色质开放元件(ubiquitously acting chromatin opening element(UCOE))，使得转化体中的目标蛋白质的产量增加。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】新载体及其应用
本专利技术涉及新载体及其应用，更具体而言，涉及对哺乳动物细胞宿主赋予来自外源基因的蛋白质的高水平生产能力的哺乳动物细胞用表达载体。本专利技术的表达载体适于特别是以大肠杆菌和酵母等作为宿主的基因重组中难以得到足够的活性、需要哺乳类独特糖链修饰和折叠的哺乳动物蛋白质的生产。
技术介绍
重组蛋白质生产用载体开发了许多，在以大肠杆菌为代表的细菌，以酵母为代表的真核微生物及以昆虫细胞作为宿主的表达体系中，蛋白质的表达量也较大。然而当使其表达哺乳动物独特的蛋白质的情况下，在无法获得正常的立体结构，在糖链添加等翻译后修饰的方面大多存在问题。因此，需要建立以哺乳动物细胞作为宿主的表达体系，但通常大多情况下表达量较低。另外，也使用了对于相比于昆虫细胞高等的动物细胞使用了重组病毒载体的表达体系，但从表达蛋白质中除去重组病毒载体的操作极其复杂，并且也不能否认病毒载体本身的危险性。对于以哺乳动物细胞作为宿主的重组蛋白质生产的事例，可见于组织性纤溶酶原激活剂(专利文献1)，促红细胞生成素(专利文献2，非专利文献1-3)，IFN-γ(非专利文献4)本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.表达载体，其包含下述(a)、(b)及(c)：/n(a)翻译阻碍性二氢叶酸还原酶基因盒(翻译阻碍性DHFR基因盒)，其为密码子被改变的翻译阻碍性DHFR基因盒，其中，对于翻译阻碍性DHFR基因盒的密码子，丙氨酸被改变为GCA，精氨酸被改变为CGA，天冬酰胺被改变为AAU，天冬氨酸被改变为GAU，半胱氨酸被改变为UGU，谷氨酰胺为CAA，谷氨酸被改变为GAA，甘氨酸被改变为GGU，组氨酸被改变为CAU，亮氨酸被改变为UUA，赖氨酸被改变为AAA，脯氨酸被改变为CCA，苯丙氨酸被改变为UUU，丝氨酸被改变为UCA，苏氨酸被改变为ACU，酪氨酸被改变为UAU，和/或缬氨酸被改变为GUA，密码子的改...

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】20180524 JP 2018-099704;20180910 JP 2018-1685911.表达载体，其包含下述(a)、(b)及(c)：
(a)翻译阻碍性二氢叶酸还原酶基因盒(翻译阻碍性DHFR基因盒)，其为密码子被改变的翻译阻碍性DHFR基因盒，其中，对于翻译阻碍性DHFR基因盒的密码子，丙氨酸被改变为GCA，精氨酸被改变为CGA，天冬酰胺被改变为AAU，天冬氨酸被改变为GAU，半胱氨酸被改变为UGU，谷氨酰胺为CAA，谷氨酸被改变为GAA，甘氨酸被改变为GGU，组氨酸被改变为CAU，亮氨酸被改变为UUA，赖氨酸被改变为AAA，脯氨酸被改变为CCA，苯丙氨酸被改变为UUU，丝氨酸被改变为UCA，苏氨酸被改变为ACU，酪氨酸被改变为UAU，和/或缬氨酸被改变为GUA，密码子的改变区域为从DHFR基因的5′末端起的DHFR基因的全长的30％以上；
(b)基因盒，其在转录活性启动子和稳定性聚腺苷酸化信号之间包含外源基因导入用克隆位点；及
(c)遍在染色质开放元件(UCOE)。


2.根据权利要求1所述的表达载体，其中，在权利要求1(a)中所述的翻译阻碍性DHFR基因盒中，作为启动子使用源自非哺乳动物细胞的基因的启动子，或除去增强子部分的启动子。


3.根据权利要求1或2所述的表达载体，其中，UCO...

【专利技术属性】
技术研发人员：铃木定彦，中川美树，龟田弥生，今内觉，冈川朋弘，前川直也，后藤伸也，佐治木大和，大桥和彦，村田史郎，北原让，山本启一，
申请(专利权)人：国立大学法人北海道大学，扶桑药品工业株式会社，
类型：发明
国别省市：日本;JP