一种生产法尼烯的酿酒酵母工程菌的构建和应用制造技术

本发明专利技术公开了一种生产法尼烯的酿酒酵母工程菌的构建和应用，属于合成生物学技术领域。本发明专利技术通过染色体整合表达MVA途径限速酶编码基因tHMG1和染色体整合融合表达ERG20与法尼烯合成酶编码基因Fsso，构建了一株产法尼烯的酿酒酵母工程菌。本发明专利技术获得的酿酒酵母工程菌构建操作简单，摇瓶发酵能够积累1.0g/L法尼烯，具有工业化应用前景。

【技术实现步骤摘要】
一种生产法尼烯的酿酒酵母工程菌的构建和应用
本专利技术涉及一种生产法尼烯的酿酒酵母工程菌的构建和应用，属于合成生物学

技术介绍
法尼烯(farnesene)，分子式为C15H24，是一种最简单的链状倍半萜化合物。自然界中，法尼烯存在α-法尼烯和β-法尼烯两种倍型。法尼烯易挥发，具有香脂香气。法尼烯合成通过法尼烯合成酶一步转化即可完成。植物中，前体法尼基焦磷酸(FPP)的天然合成途径主要包括两种：甲羟戊酸(MVA)途径和2-甲基-D-赤藻糖醇-4-磷酸(MEP)途径。通过植物提取，需要消耗大量的人力和物力，获得的法尼烯含量很低，而且成分不单一。通过代谢工程和合成生物学策略，法尼烯的微生物合成已经成功实现。目前，利用代谢工程改造酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)合成倍半萜化合物步骤复杂，且过多的代谢改造会使菌体生长负担加重，无法提供足够多的微生物细胞去合成法尼烯。
技术实现思路
为了解决现有技术中存在的问题，本专利技术提供了一种生产法尼烯的酿酒酵母工程菌。本专利技术为酿酒酵母倍半萜化合物平台菌株的构建提供了有效的策略。本专利技术的技术方案如下：本专利技术提供了一种生产法尼烯的酿酒酵母工程菌，所述酿酒酵母工程菌染色体整合表达甲羟戊酸途径限速酶编码基因tHMG1，同时整合表达法尼烯合成酶编码基因Fsso和法尼基焦磷酸合成酶编码基因ERG20；所述整合表达甲羟戊酸途径限速酶编码基因tHMG1是以GAL作为启动子，以LYS2作为整合位点；所述整合表达法尼烯合成酶编码基因Fsso和ERG20即表达ERG20-Fsso，是以GAL作为启动子，以TPI1作为终止子，以GAL80作为整合位点，融合表达法尼烯合成酶编码基因Fsso和ERG20。进一步地，所述酿酒酵母工程菌以酿酒酵母YPH499为宿主。进一步地，所述酿酒酵母工程菌以pMD-19Tsimple为整合表达载体。进一步地，所述Fsso经过密码子优化，优化后的核苷酸序列如SEQIDNO.1所示。进一步地，所述tHMG1、ERG20-Fsso均为单拷贝。本专利技术还提供了上述酿酒酵母工程菌在生产法尼烯中的应用。进一步地，将上述酿酒酵母工程菌先在YPD固体平板划线，30℃培养箱培养2-3d活化；接种活化后得到的单菌落到YPD培养基中培养18-24h进行种子培养；取种子培养液接种到YPD培养基中进行发酵，生产法尼烯。进一步地，所述种子液的接种体积比为1-5％；所述发酵的条件为28-32℃，200-220rpm。有益效果：为了提高MVA途径提供前体FPP的效率和减少FPP流向甾体合成途径及其他支路途径，本专利技术通过染色体整合表达MVA途径限速酶编码基因tHMG1和染色体整合融合表达ERG20与法尼烯合成酶编码基因Fsso，本专利技术构建了一株产法尼烯的酿酒酵母工程菌，利用摇瓶发酵可以积累1.0g/L法尼烯，具有潜在的工业化应用价值。附图说明图1是法尼烯合成流程示意图。图2是质粒Ts-80XTPso示意图。图3是质粒Ts-LYS2-tP示意图。图4是质粒Ts-80XTP101so示意图。图5是质粒Ts-80XTPEso示意图。图6是质粒Ts-80XTP101Eso示意图。图7是不同菌株法尼烯生产能力的比较。具体实施方式发酵及种子培养基：YPD培养基(10g/L酵母提取物，20g/L蛋白胨，20g/L葡萄糖)，发酵时加入10％十二烷(V/V)，使用前115℃灭菌20min。测定发酵液中法尼烯浓度的方法：仪器：ThermoFisherU3000高效液相系统；色谱柱：WatersC18柱(250×4.6mm,5μm)；流动相：甲醇、乙腈和水混合物(90:5:5)；检测条件：紫外210nm，流速0.8mL/min，柱温40℃。标准品：β-法尼烯(SIGAMA)。醋酸锂转化的方法：收集4mL菌液，离心收集菌体，用无菌水和0.1M醋酸锂溶液分别洗涤，然后依次加入240μL50％PEG3350溶液、36μL1M醋酸锂溶液、50μL鲑鱼精溶液和50μL线性化转化产物，混匀，30℃培养环境静置30min。42℃热激25min，30℃，200rpm后培养1h。本专利技术通过从酿酒酵母基因组DNA扩增了基因tHMG1、TDH3启动子、GAL启动子(GAL10-GAL1)和TPI1终止子，Fsso密码子优化和基因合成由苏州金唯智生物公司完成，最后构建甲羟戊酸途径强化和法尼烯合成表达盒。法尼烯合成流程示意图见图1。下面结合实施例和附图，对本专利技术进行具体描述。本专利技术中涉及到的酿酒酵母YPH499、酿酒酵母CICC31906均可通过购买获得。下述实施例中所用到的菌株如表1所示，表1菌株菌株基因型解释来源YPH499MATa,his3-△200,leu2-△1,trp1-△63,ura3-52,lys2-801,ade2-101ATCCWH12YPH499gal80△::PTDH3-Fsso,lys2::PGAL10-tHMG1；G418本专利技术WH16YPH499gal80△::PTDH3-ERG20-Fsso,lys2::PGAL10-tHMG1；G418本专利技术WH20YPH499gal80△::PGAL10-GAL1-Fsso,lys2::PGAL10-tHMG1；G418本专利技术WH24YPH499gal80△::PGAL10-GAL1-ERG20-Fsso,lys2::PGAL10-tHMG1；G418本专利技术下述实施例中所用到的引物如表2所示。表2引物实施例1：过表达tHMG1强化酿酒酵母法尼烯合成1.1植物来源法尼烯合成酶编码基因密码子优化和整合表达质粒构建通过SoyBase获得大豆来源法尼烯合成酶编码基因(Glyma.13G321100)序列，序列发送至苏州金唯智生物科技有限公司进行密码子优化和基因合成。优化基因命名为Fsso，Fsso由苏州金唯智生物科技有限公司连接至pUC57载体，得到质粒pUC57-Fsso，保存宿主为大肠杆菌JM109。提取质粒pUC57-Fsso，用SalI和NheI消化胶回收获得片段Fsso。以酿酒酵母YPH499基因组为模板，用引物F13和F14、F11和F12分别扩增获得PTDH3和TTPI1；以PMGKR质粒为模板，用引物F9和F10扩增获得loxp-KANMX-loxp；将loxp-KANMX-loxp、PTDH3和TTPI1用引物F9和F14进行融合PCR获得loxp-KANMX-loxp-TTPI1-PTDH；将loxp-KAN本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种生产法尼烯的酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)工程菌，其特征在于，所述酿酒酵母工程菌染色体整合表达甲羟戊酸途径限速酶编码基因tHMG1，同时整合表达法尼烯合成酶编码基因Fsso和法尼基焦磷酸合成酶编码基因ERG20；所述整合表达甲羟戊酸途径限速酶编码基因tHMG1是以GAL作为启动子，以LYS2作为整合位点；所述整合表达法尼烯合成酶编码基因Fsso和ERG20即表达ERG20-Fsso，是以GAL作为启动子，以TPI1作为终止子，以GAL80作为整合位点，融合表达法尼烯合成酶编码基因Fsso和ERG20。/n

【技术特征摘要】
1.一种生产法尼烯的酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)工程菌，其特征在于，所述酿酒酵母工程菌染色体整合表达甲羟戊酸途径限速酶编码基因tHMG1，同时整合表达法尼烯合成酶编码基因Fsso和法尼基焦磷酸合成酶编码基因ERG20；所述整合表达甲羟戊酸途径限速酶编码基因tHMG1是以GAL作为启动子，以LYS2作为整合位点；所述整合表达法尼烯合成酶编码基因Fsso和ERG20即表达ERG20-Fsso，是以GAL作为启动子，以TPI1作为终止子，以GAL80作为整合位点，融合表达法尼烯合成酶编码基因Fsso和ERG20。


2.根据权利要求1所述的酿酒酵母工程菌，其特征在于，所述酿酒酵母工程菌以酿酒酵母YPH499为宿主。


3.根据权利要求1所述的酿酒酵母工程菌，其特征在于，所述酿酒酵母工程菌以pMD-19Tsimple为整合表达...

【专利技术属性】
技术研发人员：石贵阳，王均华，李由然，朱惠霖，张梁，丁重阳，徐沙，顾正华，
申请(专利权)人：江南大学，
类型：发明
国别省市：江苏;32