棉花品种“中棉所96A”的DNA指纹图谱构建方法及其应用技术

本发明专利技术提供一种棉花品种“中棉所96A”的DNA指纹图谱构建方法及其应用，属于分子生物学领域。本发明专利技术利用SSR标记技术，提取棉花品种“中棉所96A”的基因组DNA，以提取的基因组DNA为模板，使用自主开发的60对优异标记组合进行PCR检测并构建DNA指纹图谱，并通过指纹图谱对比实现“中棉所96A”品种真伪的判断。本发明专利技术方法简单快速、准确稳定，仅需1天即可完成1份“中棉所96A”样品的DNA指纹检测。

【技术实现步骤摘要】
棉花品种“中棉所96A”的DNA指纹图谱构建方法及其应用
本专利技术属于分子生物学领域，特别是涉及棉花品种“中棉所96A”的DNA指纹图谱构建方法及其应用。
技术介绍
近年来，随着我国培育和审定棉花新品种速度在加快，推向生产的速度也在加快。然而，由于骨干亲本的集中使用与转基因技术在棉花育种中的大规模应用，棉花品种间的遗传差异越来越小，使得完全依赖传统的形态性状进行品种鉴别越来越困难。同时由于形态鉴定的时效性差，容易受到环境与主观因素的影响，品种多、乱、杂的现象难以得到有效控制，侵权行为时有发生，严重损害了育种家权益和农民利益。以分子标记为基础的DNA指纹鉴定技术具有准确可靠、简单快速、易于自动化的优点，通过构建DNA指纹图谱进行品种快速鉴定是品种鉴定技术实现产业化的前提，也是品种鉴定技术的发展趋势。这对保护棉花育成品种的知识产权和提高种子市场的种子质量具有重要意义。“中棉所96A”系中国农业科学院棉花研究所以“中棉所49”为母本，以自育品系中221为父本，杂交后通过定向选择、抗性筛选和生态选育而成的早中熟常规棉新品种，在2016-2017年的新疆区域试验中综合表现第一，2019年通过新疆农作物品种审定委员会审定。“中棉所96A”具有铃大、衣分高、抗病性好、上铃快、吐絮集中，集早熟、抗病、优质与适合机采等优点于一体的高产新品种，有望成为新疆棉种市场主导品种。但是，现在市场上缺少一种能够快速鉴别“中棉所96A”品种真伪的技术，使得“中棉所96A”真伪鉴别困难，影响该品种的大规模推广应用。专利
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种鉴别棉花品种“中棉所96A”的引物组合以及“中棉所96A”的DNA指纹图谱构建方法及其在鉴别“中棉所96A”中的应用，以解决上述现有技术存在的问题，使得能够简单快速、准确稳定的完成“中棉所96A”的真伪判断。为实现上述目的，本专利技术提供用于检测棉花品种“中棉所96A”的引物组合，所述引物组合包括下表所列的60对引物：本专利技术还提供棉花品种“中棉所96A”的DNA指纹图谱构建方法，具体包括以下步骤：1)提取棉花品种“中棉所96A”的基因组DNA；2)以步骤1)提取的基因组DNA为模板，利用所述PCR引物组合进行PCR扩增；3)检测PCR扩增产物。优选的，PCR反应体系为20μL反应体系，具体包括ddH2O13.0μL，含25mmol/LMgCl2的10×缓冲液2.0μL，dNTPs1.6μL，Taq酶0.2μL，正向引物0.1μL，反向引物0.1μL，DNA3.0μL。优选的，PCR扩增程序为：a)预变性：94℃5min；b)扩增：94℃变性45s，60℃退火45s，72℃延伸45s，进行32次循环；c)终延伸：72℃10min，d)扩增产物于4℃保存。优选的，PCR产物的检测方法为毛细管电泳法。本专利技术还提供所述的棉花品种“中棉所96A”的DNA指纹图谱构建方法在鉴别棉花品种“中棉所96A”真伪中的应用。本专利技术具有以下技术效果：本专利技术通过棉花高质量SSR标记组合的开发、分子检测试验体系的优化，建立了快速准确、经济简便、稳定可靠的棉花DNA指纹检测实验体系，并在此基础上开发一种适用于棉花品种“中棉所96A”的DNA检测方法，采用该方法不仅检测结果稳定可靠，而且操作简单方便，成本低廉，有利于技术的标准化。利用该方法对棉花品种“中棉所96A”进行检测，一份样品从送样到出结果仅需1d，且检测结果准确稳定可靠，对保障“中棉所96A”在生产上长期大面积推广应用具有重大意义。具体实施方式现详细说明本专利技术的多种示例性实施方式，该详细说明不应认为是对本专利技术的限制，而应理解为是对本专利技术的某些方面、特性和实施方案的更详细的描述。应理解本专利技术中所述的术语仅仅是为描述特别的实施方式，并非用于限制本专利技术。另外，本专利技术中的数值均为6个重复样品的平均值。对于本专利技术中的数值范围，应理解为公开了该范围的上限和下限之间的每个中间值。在任何陈述值或陈述范围内的中间值以及任何其他陈述值或在所述范围内的中间值之间的每个较小的范围也包括在本专利技术内。这些较小范围的上限和下限可独立地包括或排除在范围内。除非另有说明，否则本文使用的所有技术和科学术语具有本专利技术所述领域的常规技术人员通常理解的相同含义。虽然本专利技术仅描述了优选的方法和材料，但是在本专利技术的实施或测试中也可以使用与本文所述相似或等同的任何方法和材料。本说明书中提到的所有文献通过引用并入，用以公开和描述与所述文献相关的方法和/或材料。在与任何并入的文献冲突时，以本说明书的内容为准。在不背离本专利技术的范围或精神的情况下，可对本专利技术说明书的具体实施方式做多种改进和变化，这对本领域技术人员而言是显而易见的。由本专利技术的说明书得到的其他实施方式对技术人员而言是显而易见的。本申请说明书和实施例仅是示例性的。若未特别指明，实施例均按照常规实验条件，如Sambrook等所著的分子克隆实验手册(SambrookJ&RussellDW,Molecularcloning:alaboratorymanual,2001)，或按照制造厂商说明书建议的条件。实施例1棉花品种“中棉所96A”特征指纹图谱构建构建“中棉所96A”指纹图谱包括以下步骤：1、DNA提取试样种子充分研磨后，取100～200mg种子粉末置于2.0mL离心管，每管加入700μL的SDS提取液，混匀。65℃水浴30min，期间多次轻缓颠倒混匀。每管加入等体积的苯酚:氯仿:异戊醇(25:24:1)混合液，上下颠倒混匀至不分层，12,000rpm离心10min。吸取上清液，加入等体积预冷的异丙醇，轻轻颠倒混匀至絮状DNA成团析出。用剪口枪头吸取DNA，转移至盛有70％乙醇的离心管中洗涤一次，无水乙醇再洗涤一次，自然条件下干燥，加入200μL超纯水或TE缓冲液，充分溶解后4℃备用。2、SSR-PCR扩增使用表1引物组合CCRI001～060(如SEQIDNO.1-SEQIDNO.120所示)，PCR反应体系见表2。反应程序：a)预变性：94℃5min；b)扩增：94℃变性45s，60℃退火45s，72℃延伸45s，进行32次循环；c)终延伸：72℃10min。d)扩增产物于4℃保存。表1PCR引物信息表2PCR扩增反应体系3、毛细管电泳检测按照预先确定的组合引物，等体积取同一组合引物的不同荧光标记的扩增产物，充分混匀。从混合液中吸取1μL，加入到基因测序仪专用96孔上样板上。每孔再分别加入0.15μL分子量内标和8.85μL去离子甲酰胺，95℃变性5min，冷却10min以上，瞬时离心10s后备用。打开基因测序仪，检查仪器工作状态和试剂状态。将装有样品的96孔上样板放置于样品架基座上，将装有电极本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.用于检测棉花品种“中棉所96A”的引物组合，其特征在于，所述引物组合包括下表所列的60对引物：/n

【技术特征摘要】
1.用于检测棉花品种“中棉所96A”的引物组合，其特征在于，所述引物组合包括下表所列的60对引物：

















2.棉花品种“中棉所96A”的DNA指纹图谱构建方法，其特征在于，包括以下步骤：
1)提取棉花品种“中棉所96A”的基因组DNA；
2)以步骤1)提取的基因组DNA为模板，利用权利要求1所述PCR引物组合进行PCR扩增；
3)检测PCR扩增产物。


3.如权利要求2所述的棉花品种“中棉所96A”的DNA指纹图谱构建方法，其特征在于，PCR反应体系为20μL反应体系，具体包括ddH2O13.0μL，含25mmol/LMgCl...

【专利技术属性】
技术研发人员：匡猛，张西岭，彭军，黄殿成，周大云，孙君灵，黄龙雨，吴玉珍，张鹏飞，彭凯，王延琴，
申请(专利权)人：中国农业科学院棉花研究所，
类型：发明
国别省市：河南;41