【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】周质空间中蛋白质的酵母展示相关申请的交叉引用本申请要求2017年12月11日提交的美国临时申请号62/597,388的优先权，其内容通过引用以其整体并入本文。关于联邦政府资助研究的声明本专利技术是在政府支持下在美国国家科学基金会授予的批准号1747391下进行的。政府享有本专利技术的一定权利。
本公开文本涉及细胞展示和蛋白质文库的高通量筛选的方法。具体地，本公开文本涉及用于在酵母的周质空间中展示蛋白质的方法以及此类方法用于针对特定结合或功能特征筛选蛋白质文库的用途。
技术介绍
已经证明了分子展示技术对于发现、生产和优化用于各种生物技术和生物医学应用的蛋白质和肽是非常有价值的。已经开发了各种方法，包括噬菌体展示(Smith(1985)Science228:1315-1317)、mRNA(Wilson等人(2001)Proc.Natl.Acad.Sci.USA98:3750-3755)和DNA展示(Yonezawa等人(2003)NucleicAcidsRes.31:e118)、核糖体展示(Han...
【技术保护点】
1.一种酵母周质展示文库，所述酵母周质展示文库包含多个酵母宿主细胞，其中每个酵母宿主细胞包含：/na)用于在酵母宿主细胞周质空间中展示的抗体，其中所展示的抗体在每个酵母宿主细胞中是不同的，使得所述多个酵母宿主细胞展示多种抗体；/nb)周质锚定蛋白，其中所述周质锚定蛋白连接到所述抗体，使得所述抗体展示在所述周质空间中；以及/nc)目的靶膜蛋白，其中所述目的膜蛋白定位在所述酵母宿主细胞质膜中并且是所述酵母宿主细胞周质空间中展示的所述抗体可及的。/n
【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】20171211 US 62/597,3881.一种酵母周质展示文库，所述酵母周质展示文库包含多个酵母宿主细胞，其中每个酵母宿主细胞包含：
a)用于在酵母宿主细胞周质空间中展示的抗体，其中所展示的抗体在每个酵母宿主细胞中是不同的，使得所述多个酵母宿主细胞展示多种抗体；
b)周质锚定蛋白，其中所述周质锚定蛋白连接到所述抗体，使得所述抗体展示在所述周质空间中；以及
c)目的靶膜蛋白，其中所述目的膜蛋白定位在所述酵母宿主细胞质膜中并且是所述酵母宿主细胞周质空间中展示的所述抗体可及的。
2.根据权利要求1所述的酵母周质展示文库，其中所述抗体和所述周质锚定蛋白在复合物中通过分子结合相互作用非共价连接在一起，或者在复合物中通过共价非肽键连接。
3.根据权利要求1所述的酵母周质展示文库，其中所述抗体和所述周质锚定蛋白在融合蛋白中共价连接在一起。
4.根据权利要求1-3中任一项所述的酵母周质展示文库，其中所述周质锚定蛋白还包含信号序列，所述信号序列引导所述周质锚定蛋白向所述酵母宿主细胞周质、质膜或细胞壁的转运，使得所述抗体展示在所述周质中。
5.根据权利要求1-3中任一项所述的酵母周质展示文库，其中所述周质锚定蛋白包含将所述抗体伸出至所述周质中的跨越膜的跨膜结构域或膜结合蛋白结构域。
6.根据权利要求5所述的酵母周质展示文库，其中所述膜结合蛋白结构域是糖基磷脂酰肌醇(GPI)-质膜锚定结构域。
7.根据权利要求6所述的酵母周质展示文库，其中所述GPI-质膜锚定结构域是yapsinGPI质膜锚定结构域。
8.根据权利要求7所述的酵母周质展示文库，其中所述yapsinGPI质膜锚定结构域是YPS1、YPS2、YPS3、YPS4、YPS5、YPS6或YPS7yapsinGPI质膜锚定结构域。
9.根据权利要求2所述的酵母周质展示文库，其中所述周质锚定蛋白是结合所述细胞壁的内表面，使得所述抗体被伸出至所述周质中的蛋白质。
10.根据权利要求3所述的酵母周质展示文库，其中所述周质锚定蛋白是结合所述细胞壁的内表面的将所述融合蛋白伸出至所述周质中的蛋白质。
11.根据权利要求2所述的酵母周质展示文库，其中所述周质锚定蛋白足够大而使得所述周质锚定蛋白和连接的抗体保留在所述周质中。
12.根据权利要求3所述的酵母周质展示文库，其中所述周质锚定蛋白足够大而使得所述融合蛋白保留在所述周质中。
13.一种酵母周质展示文库，所述酵母周质展示文库包含多个酵母宿主细胞，其中每个酵母宿主细胞包含：
a)用于在酵母宿主细胞周质空间中展示的抗体，其中所展示的抗体在每个酵母宿主细胞中是不同的，使得所述多个酵母宿主细胞展示多种抗体，其中所述抗体连接到信号序列，所述信号序列引导所述抗体向所述酵母宿主细胞周质、质膜或细胞壁的转运，使得所述抗体展示在所述酵母宿主细胞周质空间中；以及
b)目的靶膜蛋白，其中所述目的膜蛋白定位在所述酵母宿主细胞质膜中并且是所述酵母宿主细胞周质空间中展示的所述抗体可及的。
14.根据权利要求1-13中任一项所述的酵母周质展示文库，其还包括报告系统，所述报告系统包含可操作地连接到当激活所述目的靶膜蛋白时被激活的诱导型启动子的报告基因，以便允许检测在所述抗体与所述目的靶膜蛋白结合时所述目的靶膜蛋白的活性增加或降低。
15.根据权利要求14所述的酵母周质展示文库，其中所述报告基因是营养标记、抗生素抗性标记、荧光标记、生物发光标记或反向可选择标记。
16.根据权利要求15所述的酵母周质展示文库，其中所述营养标记选自HIS3、HIS7、ARG6、LEU2、URA3和TRP1。
17.根据权利要求15所述的酵母周质展示文库，其中所述抗生素抗性标记赋予对于抗生素的抗性，所述抗生素选自遗传霉素、zeocin、潮霉素B、诺尔斯菌素和双丙氨膦。
18.根据权利要求15所述的酵母周质展示文库，其中所述荧光标记选自绿色荧光蛋白、红色荧光蛋白、蓝色荧光蛋白、青色荧光蛋白、黄色荧光蛋白和橙色荧光蛋白。
19.根据权利要求15所述的酵母周质展示文库，其中所述生物发光标记是萤光素酶或水母发光蛋白。
20.根据权利要求15所述的酵母周质展示文库，其中所述反向可选择标记选自CAN1、URA3、MET15、TRP1和TK。
21.根据权利要求14所述的酵母周质展示文库，其中所述报告基因是可选择标记，使得在所述抗体与所述目的靶膜蛋白结合时所述目的靶膜蛋白的所述活性增加可通过阳性选择培养基上所述酵母宿主细胞的生长来检测。
22.根据权利要求14所述的酵母周质展示文库，其中所述报告基因是反向可选择标记，使得在所述抗体与所述目的靶膜蛋白结合时所述目的靶膜蛋白的所述活性降低可通过阴性选择培养基上所述酵母宿主细胞的生长来检测。
23.根据权利要求1-22中任一项所述的酵母周质展示文库，其中所述目的靶膜蛋白选自受体、离子通道和转运蛋白。
24.根据权利要求23所述的酵母周质展示文库，其中所述受体是G蛋白偶联受体(GPCR)。
25.根据权利要求24所述的酵母周质展示文库，其中所述GPCR是外源性GPCR。
26.根据权利要求25所述的酵母周质展示文库，其中所述酵母宿主细胞还包含内源性GPCR。
27.根据权利要求25或26所述的酵母周质展示文库，其还包含能够被所述外源性GPCR激活的工程化Gα亚基，其中所述激活的工程化Gα亚基能够激活所述酵母宿主细胞中的可检测的信息素应答。
28.根据权利要求27所述的酵母周质展示文库，其中所述工程化Gα亚基是嵌合G蛋白α(Gα)亚基，其包含酵母Gα亚基的N末端结构域和外源性Gα亚基的C末端结构域。
29.根据权利要求28所述的酵母周质展示文库，其中所述酵母Gα亚基属于Gαi、Gαq、Gαs或Gαo家族G蛋白。
30.根据权利要求25-29中任一项所述的酵母周质展示文库，其中所述外源性GPCR是哺乳动物GPCR。
31.根据权利要求30所述的酵母周质展示文库，其中所述酵母Gα亚基的至少5个C末端残基被哺乳动物Gα亚基的对应C末端残基替换，使得所述嵌合Gα亚基能够被所述哺乳动物GPCR激活。
32.根据权利要求31所述的酵母周质展示文库，其中所述酵母Gα亚基的至少20个C末端残基被所述哺乳动物Gα亚基的对应C末端残基替换，使得所述嵌合Gα亚基能够被所述哺乳动物GPCR激活。
33.根据权利要求31或32所述的酵母周质展示文库，其中所述哺乳动物Gα亚基选自Gα-S、Gα-I、Gα-O、Gα-T、Gα-Z、Gα-Q、Gα-11、Gα-12、Gα-13和转导蛋白。
34.根据权利要求28-33中任一项所述的酵母周质展示文库，其中所述嵌合Gα亚基包含所述酵母Gα亚基的至少41个N末端残基。
35.根据权利要求30-34中任一项所述的酵母周质展示文库，其中所述哺乳动物GPCR是人GPCR。
36.根据权利要求35所述的酵母周质展示文库，其中所述人GPCR选自
CXCR4、CXCR5、SSTR2、MOR、AVPR2、FPR2/ALX、ADORA2A、CHRM3、CGRP2、CCR2、CCR4、CCR5、CHRM4、PAC1、b2AR、CXCR2、CYSLTR2、KSHVvGPCR、PKR1、PKR2、CB1、CB2、A3AR和AT1R。
37.根据权利要求24-36中任一项所述的酵母周质展示文库，其中所述目的GPCR靶膜蛋白具有组成型非配体依赖性活性。
38.根据权利要求24-37中任一项所述的酵母周质展示文库，其中所述酵母宿主细胞是用于选择所述目的GPCR靶膜蛋白的抗体拮抗剂的FAR1菌株。
39.根据权利要求24-36中任一项所述的酵母周质展示文库，其中所述酵母宿主细胞是用于选择所述目的GPCR靶膜蛋白的抗体激动剂的Δfar1菌株，所述Δfar1菌株包含可操作地连接到报告基因的信息素诱导型PRM1启动子。
40.根据权利要求1-39中任一项所述的酵母周质展示文库，其中所述抗体选自单克隆抗体、嵌合抗体、人源化抗体、纳米抗体、抗体的重组片段、Fab片段、Fab'片段、F(ab')2片段、Fv片段和scFv片段。
41.根据权利要求1-40中任一项所述的酵母周质展示文库，其中所述目的靶膜蛋白包含增加或降低其活性的突变。
42.根据权利要求1-40中任一项所述的酵母周质展示文库，其中所述酵母宿主细胞是Δfar1、Δsst2、Δste14、Δste3或Δmat菌株。
43.根据权利要求42所述的酵母周质展示文库，其中所述酵母宿主细胞是包含缺失或失活的MATα基因座或者缺失或失活的MATa基因座的Δmat菌株。
44.根据权利要求1-43中任一项所述的酵母周质展示文库，其中所述酵母宿主细胞还包含经修饰的CLN3蛋白，所述经修饰的CLN3蛋白包含与野生型CLN3蛋白相比增加所述酵母宿主细胞中CLN3的丰度的C末端截短。
45.根据权利要求44所述的酵母周质展示文库，其中所述经修饰的CLN3蛋白至少保留所述野生型CLN3蛋白的N末端氨基酸1-387。
46.根据权利要求44所述的酵母周质展示文库，其中所述经修饰的CLN3蛋白至少保留所述野生型CLN3蛋白的N末端氨基酸1-408。
47.根据权利要求1-46中任一项所述的酵母周质展示文库，其中所述酵母宿主细胞是单倍体或二倍体酵母宿主细胞。
48.一种制备根据权利要求1所述的酵母周质展示文库的方法，所述方法包括：
a)提供第一多个编码用于在酵母宿主细胞周质空间中展示的抗体的重组多核苷酸，其中所展示的抗体在每个酵母宿主细胞中是不同的，使得所述多个酵母宿主细胞展示多种抗体；
b)提供编码所述周质锚定蛋白的第二重组多核苷酸，其中所述周质锚定蛋白连接到所述抗体，使得所述抗体展示在所述周质空间中；
c)用所述第一多个重组多核苷酸和所述第二重组多核苷酸转染所述多个酵母宿主细胞；
d)用编码所述目的靶膜蛋白的重组多核苷酸转染所述多个酵母宿主细胞；以及
e)在允许所述抗体、所述周质锚定蛋白和所述目的靶膜蛋白表达的条件下培养所述多个酵母宿主细胞，其中每个酵母宿主细胞在所述周质空间中展示不同抗体，并且所述目的靶膜蛋白定位到质膜，使得产生根据权利要求1所述的酵母周质展示文库。
49.根据权利要求48所述的方法，其中编码所述抗体的所述重组多核苷酸或编码所述周质锚定蛋白或所述目的靶膜蛋白的所述重组多核苷酸通过表达载体提供。
50.根据权利要求48所述的方法，其中编码所述抗体的所述重组多核苷酸或编码所述周质锚定蛋白或所述目的靶膜蛋白的所述重组多核苷酸整合到酵母宿主细胞基因组中的靶基因座处。
51.一种制备根据权利要求3所述的酵母周质展示文库的方法，所述方法包括：
a)提供多个编码融合蛋白的重组多核苷酸，其中每个重组多核苷酸编码不同的融合蛋白，所述融合蛋白包含连接到用于展示的不同抗体的周质锚定蛋白；
b)用所述多个编码所述融合蛋白的重组多核苷酸转染多个酵母宿主细胞；
c)用编码目的靶膜蛋白的重组多核苷酸转染所述多个酵母宿主细胞；以及
d)在允许所述融合蛋白和所述目的靶膜蛋白表达的条件下培养所述多个酵母宿主细胞，其中每个酵母宿主细胞在周质空间中展示不同抗体，并且所述目的靶膜蛋白定位到质膜，使得产生根据权利要求3所述的酵母周质展示文库。
52.根据权利要求51所述的方法，其中编码所述融合蛋白的所述重组多核苷酸或编码所述目的靶膜蛋白的所述重组多核苷酸通过表达载体提供。
53.根据权利要求51所述的方法，其中编码所述融合蛋白或所述目的靶膜蛋白的所述重组多核苷酸整合到酵母宿主细胞基因组中的靶基因座处。
54.根据权利要求48-53中任一项所述的方法，其中所述目的靶膜蛋白选自受体、离子通道和转运蛋白。
55.根据权利要求54所述的方法，其中所述受体是G蛋白偶联受体(GPCR)。
56.根据权利要求48-55中任一项所述的方法，其还包括将编码能够被所述GPCR激活的工程化Gα亚基的重组多核苷酸引入到所述多个酵母宿主细胞中，其中所述激活的工程化Gα亚基能够激活所述酵母宿主细胞中的可检测的信息素应答。
57.根据权利要求56所述的方法，其中所述工程化Gα亚基是嵌合G蛋白α(Gα)亚基，其包含酵母Gα亚基的N末端结构域和外源性Gα亚基的C末端结构域。
58.根据权利要求57所述的方法，其中所述酵母Gα亚基属于Gαi、Gαq、Gαs或Gαo家族G蛋白。
59.根据权利要求57或58所述的方法，其中所述外源性Gα亚基是哺乳动物Gα亚基。
60.根据权利要求59所述的方法，其中所述酵母Gα亚基的至少5个C末端残基被哺乳动物Gα亚基的对应C末端残基替换，使得所述嵌合Gα亚基能够被所述哺乳动物GPCR激活。
61.根据权利要求60所述的方法，其中所述酵母Gα亚基的至少20个C末端残基被所述哺乳动物Gα亚基的对应C末端残基替换，...
【专利技术属性】
技术研发人员：R·于，C·G·佩斯，R·巴尔塔纳斯，B·罗宾逊，
申请(专利权)人：鲍鱼生物股份有限公司，
类型：发明
国别省市：美国;US
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