通过电容型电位测量装置测量细胞内电位的方法制造方法及图纸

本发明专利技术的目的在于提供通过对细胞的侵入性小且不需要熟练技术的简便方法来准确地测量和控制细胞内电位的方法。本发明专利技术通过预先导入有导电性纳米粒子的目标细胞的细胞表面上粘附的磁铁电极或者与导电性板电极接触的磁铁而来的磁力，将细胞内的导电性纳米粒子吸引到与上述电极的粘附面侧，贯通细胞膜而使细胞外的一端与磁铁电极或导电性板电极接触，或者使吸附在磁铁电极表面的导电性纳米粒子粘附在目标细胞的上方并被设置在细胞下方的铁板吸引而贯通细胞膜，由此留下与磁铁电极接触的细胞外的一端。与该导电性纳米粒子接触的导电性板与导电板(铝箔)一起形成电容器，或者在磁铁电极的上方隔着绝缘体设置磁性体而形成电容器，通过该电容器作为传感器感应目标细胞内的电荷变化，并转换为电压变化，从而能够测量细胞内电位。此外，可以观察向外液中给予的受检试剂对细胞的影响。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】通过电容型电位测量装置测量细胞内电位的方法
本专利技术涉及使用电容型电位测量装置(Capacitivepotentialdetectiondevice)、利用电荷放大器(チャージアンプ)原理来测量细胞内膜电位(细胞内电位)的方法。
技术介绍
所有细胞在细胞内和细胞外具有不同的离子组成，通过保持其离子分布差异及其离子组成差异的转运蛋白(例如钠泵)来保持细胞内电位(膜电位)。在静息状态下，膜电位虽稳定(静息膜电位)，但由于膜表面的离子通道被活化并打开，因膜内外的离子浓度差，离子一下子放出或流入，整个细胞内的电位发生变化(发生去极化或超极化)，导致细胞内电位发生变化。其结果是，在心肌和神经中引起动作电位的产生/传递，引起激素和神经递质的释放等信息传递，在心肌和骨骼肌细胞中引起收缩。一直以来，通过测量细胞的膜电位变动、与此相伴的通过离子通道的膜电流，可对细胞的状态变化和细胞对药物等的响应进行观察。特别是在药物发现筛选(創薬スクリーニング)时，将培养的心肌细胞、神经细胞等暴露于药物发现候选药物，测量膜电位的变化而对心脏毒性、神经毒性等进行评价正在广泛进行。为了测量细胞内电位，以往在细胞内插入金属制电极或充满电解液的微玻璃电极，测量与细胞外的电极的电流或电压。最近，建立了基于膜片钳(PatchClamp)法的测量法，并已成为主流。膜片钳法是指通过使充满细胞内电解液的玻璃移液管(ピペット)和细胞膜紧密粘附，使玻璃移液管和细胞电一体化，精确测量、控制细胞内电位变化的方法。膜片钳法包括测量在整个细胞中表达的离子通道的动态的全细胞模式；测量仅在膜片移液管内径内的细胞膜中含有的离子通道的动态(单通道活性)的方法(细胞贴附(oncell)模式)；还有从细胞中分离出其微细胞膜进行测量的方法(内膜片(insidepatch)、外膜片(outsidepatch)模式)。在全细胞模式中，通过刺破与玻璃移液管粘附的电极的内径上的细胞膜，测量细胞内电位变化、通过整个细胞中的离子通道的电流(离子通道的活性)的动态。由于上述技术是在显微镜下对单个细胞直接使用电极进行的记录法，因此需要高度熟练的技术以及较高的专业知识。这些细胞内记录法(电压钳、电流钳)以膜片钳法(全细胞膜片)为代表，能够观察通过细胞膜中表达(存在)的离子通道的离子的动态。在电压钳模式中，通过包含在膜片钳放大器中的反馈功能可以有效地控制细胞内的电位，并且可以将由离子通道开闭引起的快速(以毫秒为单位的)现象记录为离子电流变化。在电流钳模式中，可以将因离子通道的活动对细胞的作用记录为(膜)电位变化。膜片钳方法中包括手动(手动式)膜片钳法和自动膜片钳法，手动膜片钳法在电生理学测量中的数据可靠性高。然而，由于操作人员使用显微镜、操作操纵器(マニピュレーター)进行实验等的手法复杂且需要丰富的专业知识，因此效率非常差。这在医学生物学研究，特别是在药物发现领域中已经成为一大障碍。另一方面，自动膜片钳法是自动化的电生理学测量仪器，近年来虽然性能显著提高，但在数据可靠性方面，还没有获得能够取代手动膜片钳法的程度的可靠性。此外，由于自动膜片钳试验仪器非常昂贵，其使用仅限于一些大制药企业。此外，近年来，作为为了测量细胞内电位而使电极贯通细胞膜的方法，代替膜片钳法，开发了对细胞施加高电压进行电穿孔的方法(非专利文献3)，据报道能够记录大鼠心肌细胞的细胞内电位。然而，在该方法中，由于被穿孔破坏的细胞膜被立即修复，电极进入细胞内的通路(アクセス)消失，因此不能说是实用的方法。相对于这样的细胞内记录法，近年来，在细胞外记录电变化的细胞外记录法的开发也有所进步并已广泛利用。细胞外记录法是以体外多点平面电极(多电极阵列)系统为代表，通过在细胞外与细胞接触放置的电极在细胞外记录电变化的方法(专利文献1～专利文献4)。作为体外多点平面电极(多电极阵列，MEA)系统的应用，已开始用于培养神经细胞的可塑性研究和使用人iPS细胞来源的神经细胞、心肌细胞的药物安全性试验等。然而，MEA由于是细胞外记录而容易进行细胞操作，但只能记录交流样的变化(膜电位的单位时间变化、微分波形)，因此无法测量细胞内发生的缓慢的膜电位变化。因此，通过测量获得的信息有限，其应用有限。作为用基于MEA的方法尝试细胞内记录的报道，虽然有通过在蘑菇形状的电极上接种细胞并对其施加高电压而成功破坏细胞膜的例子，但保持细胞内电位的记录条件的时间短，没有显示出作为记录方法的有效性(非专利文献1)。由以上可知，尽管有MEA这样容易操作且稳定的细胞外记录法，但是仍期望提供一种能够以与手动膜片钳法同等或其以上的高精度进行膜电位的测量、并且不仅在细胞群中而且在培养神经细胞等这样的单细胞的状态下也能够测量细胞内电位的方法(非专利文献4)。现有技术文献专利文献专利文献1：WO2012/043820专利文献2：WO2013/061849专利文献3：WO2014/098182专利文献4：日本特表2005-505761号公报非专利文献非专利文献1：AnnaFendyur等，FrontiersinNeuroengineering，Dec.2011，Vol.4，Article14，p.1-14非专利文献2：RaphaelLevy等，NanoReviews2010，1：4889-DOI：10.3402/nano.v1i0.4889非专利文献3：MichaE.Spira等，NatureNanotechnologyVol.8(Feb.2013)p.83-94/DOI:10.1038/NNANO.2012.265非专利文献4：KhudhairD.等，(2017)EmergingTrendsinNeuroEngineeringandNeuralComputation.pp.41-59
技术实现思路
专利技术要解决的技术问题本专利技术的目的在于提供通过对细胞的侵入性小且不需要熟练技术的简便方法来准确地测量单个细胞单元或细胞群(片状(シート状)细胞或细胞团)的细胞内电位的方法。特别是，本专利技术的目的在于提供能够在不能以片状方式培养的细胞(典型地是培养神经细胞)等中记录在细胞内产生的动作电位或其变化的方法。解决技术问题的技术手段在想要准确地测量细胞内电位的情况下，将玻璃微电极插入细胞内，通过放大器(アンプ)放大与细胞外电极(接地电极(アース))的电位差，并用监测器进行观察。近年来，金纳米粒子不仅作为免疫学诊断用试剂盒、还作为针对包括人细胞的哺乳动物细胞的核酸和各种药剂等的递送用载体而广泛使用，对细胞的负荷少的细胞内导入法的开发也在进行中(非专利文献2)，除此之外，本专利技术人等还关注于金纳米粒子的细胞毒性极低且有导电性的特性，提出了用导入细胞内的金纳米粒子代替玻璃微电极的设想。本专利技术人等进行深入研究的结果是，使用金涂覆磁性纳米粒子，隔着导电性玻璃板(ガラスプレート)用强磁铁吸引细胞内的金纳米粒子，使本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种电容型电位测量装置，所述电容型电位测量装置为能够记录目标细胞的细胞内电位或电位变化的电容型电位测量装置，其特征在于，/n所述电容型电位测量装置包含与贯通目标细胞的细胞膜的导电性纳米粒子暴露于细胞外的一端在细胞外接触的导电性板，在设置成与所述导电性板的下面接触的导电板的下方设置有磁铁。/n

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】20180427 JP 2018-0876891.一种电容型电位测量装置，所述电容型电位测量装置为能够记录目标细胞的细胞内电位或电位变化的电容型电位测量装置，其特征在于，
所述电容型电位测量装置包含与贯通目标细胞的细胞膜的导电性纳米粒子暴露于细胞外的一端在细胞外接触的导电性板，在设置成与所述导电性板的下面接触的导电板的下方设置有磁铁。


2.如权利要求1所述的电容型电位测量装置，其特征在于，导电性板是在表面的至少一部分具有胶原涂布区域的导电性玻璃。


3.如权利要求1或2所述的电容型电位测量装置，其特征在于，导电性板上面与电信号放大器的正极连接，与导电性板下面接触的导电板与电信号放大器的负电极连接，由导电性板上面和导电板形成电容型电位记录电路。


4.一种电容型电位测量装置，所述电容型电位测量装置为能够记录目标细胞的细胞内电位或电位变化的电容型电位测量装置，其特征在于，
所述电容型电位测量装置包含与贯通目标细胞的细胞膜的导电性纳米粒子暴露于细胞外的一端在细胞外接触的磁铁电极，所述磁铁电极除了与目标细胞接触的下面以外都被绝缘体覆盖并垂直固定，隔着绝缘体在上面还具有磁性体或磁铁吸引性金属板，在与所述细胞粘附的容器底面的下方设置有磁铁吸引性金属板。


5.如权利要求4所述的电容型电位测量装置，其特征在于，覆盖所述磁铁电极与目标细胞接触的下面以外的绝缘体不与目标细胞所粘附的下方的基板表面接触，与磁铁电极的下面接触的目标细胞不与细胞外液隔离。


6.如权利要求4或5所述的电容型电位测量装置，其中，贯通细胞膜的导电性纳米粒子是预先吸附在磁铁电极表面的导电性纳米粒子被所述磁铁电极从目标细胞上方压在细胞表面上，并被设置在细胞下方的金属板吸引而贯通细胞膜的导电性纳米粒子。


7.如权利要求6所述的电容型电位测量装置，其特征在于，在预先吸附在磁铁电极表面时，使导电性纳米粒子在与转染试剂混合的状态下吸附在磁铁电极表面。


8.如权利要求4～7中任一项所述的电容型电位测量装置，其特征在于，磁铁电极与电信号放大器的正极连接，在磁铁电极上面隔着绝缘体设置的磁性体或磁铁吸引性金属板与电信号放大器的负电极连接，由磁铁电极和磁性体或磁铁吸引性金属板形成电容型电位记录电路。


9.一种用于测量目标细胞的细胞内电位或电位变化的方法，其特征在于，所述方法包括以下工序(1)～工序(3)：
(1)向粘附在导电性板上的目标细胞内导入导电性纳米粒子的工序，
其中，将导电板设置成与导电性板下面接触，所述导电板的下方设置有磁铁；
(2)通过来自于导电性板下方的磁铁的磁力将目标细胞内的导电性纳米粒子吸引至细胞粘附面侧，使导电性纳米粒子贯通细胞粘附面的至少一部分的细胞膜，使其暴露于细胞外的一端与所述导电性板接触的工序；
(3)将所述导电性板上面连接到电信号放大器的正极并将所述导电板连接到电信号放大器的负电极以形成电位记录电路的工序。


10.一种用于测量目标细胞的细胞内电位或电位变化的方法，其特征在于，所述方法包括以下工序(1)～工序(4)：
(1)向粘附在容器底面的目标细胞内导入导电性纳米粒子的工序；
(2)将磁铁电极粘附在目标细胞的上面的工序，
其中，所述磁铁电极除了与目标细胞的粘附面以外都被绝缘体覆盖，在所述磁铁电极的上面隔着绝缘体设置有磁性体或磁铁吸引性金属板；
(3)在与所述细胞粘附的容器底面的下方设置磁铁吸引性金属板，通过在所述磁铁电极和下方的金属板之间产生的磁力将导电性纳米粒子吸引至与磁铁电极的粘附面侧并贯通细胞膜，使暴露于细胞外的一端与所述磁铁电极接触的工序；
(4)将所述磁铁电极连接到电信号放大器的正极并将上方的所述磁性体或磁铁吸引性金属板连接到电信号放大器的负电极以形成电位记录电路的工序。


11.一种用于测量目标细胞的细胞内电位或电位变化的方法，其特征在于，所述方法包括以下工序(1)～工序(4)：
(1)将导电性纳米粒子吸附在磁铁电极未被绝缘体覆盖的表面的工序；
(2)将吸附有导电性纳米粒子的磁铁电极表面从目标细胞上方粘附并压在细胞表面的工序，
其中，磁铁电极的上面隔着绝缘体设置有磁性体或磁铁吸引性金属板；
(3)在与所述细胞粘附的容器底面的下方设置磁铁吸引性金属板，通过在所述磁铁电极和下方的金属板之间产生的磁力将磁铁电极表面的导电性纳米粒子吸引至所述细胞的内侧方向，留下与磁铁电极接触的细胞外的一端而贯通细胞膜的工序；
(4)将所述磁铁电极连接到电信号放大器的正极并将设置在磁铁电极上方的所述磁性体或磁铁吸引性金属板连接到电信号放大器的负电极以形成电位记录电路的工序。


12.一种筛选对目标细胞具有毒性作用或活性作用的物质的方法，其特征在于，所述方法包括以下(1)～(6)：
(1)向粘附在导电性板上的目标细胞内导入导电性纳米粒子的工序，
其中，将导电板设置成与导电性板下面接触，所述导电板的下方设置有磁铁；
(2)通过来自于导电性板下方的磁铁的磁力将目标细胞内的导电性纳米粒子吸引至细胞粘附面侧，使导电性纳米粒子贯通细胞粘附面的至少一部分的细胞膜，使其暴露于细胞外的一端与所述导电性板接触的工序；
(3)将所述导电性板上面连接到电信号放大器的正极并将所述导电板连接到电信号放大器的负电极以形成电位记录电路，测量两个电极之间的电压的工序；
(4)对目标细胞给予受检物质样品的工序；
(5)对于在工序(4)中给予受检物质样品的目标细胞，与工序(3)同样地测量两个电极之间的电压...

【专利技术属性】
技术研发人员：斋藤光义，
申请(专利权)人：离子通道与转运研究公司，斋藤光义，
类型：发明
国别省市：日本;JP