一种联苯降解菌的单细胞分离快速筛选方法技术

本发明专利技术公开了一种联苯降解菌的单细胞分离快速筛选方法，包括对自然土样进行预处理后密度梯度离心的中下层液体为纯净菌液；将其稀释至所需浓度后以单个液滴的形式分别注入到细胞培养板的每个微孔中，使每颗液滴中包含一至几个菌体；恒温震荡培养，定期测定每个微孔中的菌量和联苯降解中间产物量，并分别绘制每个微孔中菌量和中间产物量随时间的变化曲线；吸取曲线出峰的微孔中的菌液，将其涂布于喷洒联苯的无机盐培养基上进行培养，培养形成菌落后鉴定其属种。本发明专利技术省去了富集培养与分离纯化的步骤，直接从单细胞层面进行培养与鉴别，大大节省了筛选新菌株所需的时间，本发明专利技术不止能用于筛选联苯降解菌，也可以推广到筛选其它合适的环境功能菌。

【技术实现步骤摘要】
一种联苯降解菌的单细胞分离快速筛选方法
本专利技术属于环境微生物工程领域，具体涉及一种联苯降解菌的单细胞分离快速筛选方法。
技术介绍
联苯(Diphenyl)是一类重要的有机原料，被用于合成增塑剂、防腐剂、制造燃料，广泛应用于医药、化工等领域中。但同时，联苯难降解，易挥发，本身具有一定毒性，大量吸入能导致肌肉萎缩，损害中枢系统和肝脏，是一类常见的有机污染物。多氯联苯(Polychorinatedbiphenyls，PCBs)是联苯的一类同系物，由联苯中的氢原子被氯原子不同程度取代所形成。因为其难降解性和高生物毒性，目前受到广泛关注。据报道，联苯降解微生物同样具有降解多氯联苯的能力。针对联苯污染的土壤，常用的修复方法包括物理法(客土法、热处理、淋洗法等)以及化学法(化学氧化还原法)。但这些方法大多存在对土壤结构破坏大、易造成二次污染、不够经济等问题，更适用于修复污染浓度高的小块污染场地。而利用微生物降解联苯的生物修复法，因为安全、经济、环保等优点，成为该领域的研究热点。生物修复法的关键是要有能高效降解联苯的菌种。而目前常用的联苯降本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种联苯降解菌的单细胞分离快速筛选方法，其特征在于，具体如下：/nS1：对自然土样进行预处理以去除杂质，得到初始菌液；/nS2：对所述初始菌液密度梯度离心，弃去一半体积的上层清液后，剩余的中下层液体为不含土壤颗粒的纯净菌液；/nS3：确定所述纯净菌液的菌浓度，并将其稀释至所需浓度，得到稀释菌液；/nS4：将所述稀释菌液以单个液滴的形式分别注入到细胞培养板的每个微孔中，使每颗液滴中包含一至几个菌体，得到菌液培养板；所述细胞培养板的每个微孔中均等量加入含有联苯的无机盐培养基；/nS5：将所述菌液培养板恒温震荡培养，定期测定每个微孔中的菌量和联苯降解中间产物量，并分别绘制每个微孔中菌量和中间产物...

【技术特征摘要】
1.一种联苯降解菌的单细胞分离快速筛选方法，其特征在于，具体如下：
S1：对自然土样进行预处理以去除杂质，得到初始菌液；
S2：对所述初始菌液密度梯度离心，弃去一半体积的上层清液后，剩余的中下层液体为不含土壤颗粒的纯净菌液；
S3：确定所述纯净菌液的菌浓度，并将其稀释至所需浓度，得到稀释菌液；
S4：将所述稀释菌液以单个液滴的形式分别注入到细胞培养板的每个微孔中，使每颗液滴中包含一至几个菌体，得到菌液培养板；所述细胞培养板的每个微孔中均等量加入含有联苯的无机盐培养基；
S5：将所述菌液培养板恒温震荡培养，定期测定每个微孔中的菌量和联苯降解中间产物量，并分别绘制每个微孔中菌量和中间产物量随时间的变化曲线；
S6：吸取菌量或中间产物量变化曲线出峰的微孔中的菌液，将其涂布于喷洒联苯的无机盐培养基上进行培养，培养形成菌落后鉴定其属种。


2.根据权利要求1所述单细胞分离快速筛选方法，其特征在于，所述S1中预处理过程具体如下：
S11：将自然土样与0.1％的胆酸钠溶液混合，震荡摇匀后得到土壤匀浆，将所述土壤匀浆离心并收集上清液；
S12：重复S11多次，将得到的上清液全部收集后得到预备菌液；
S13：将所述预备菌液过孔径为40μm的细胞筛以去除杂质，离心后弃去上层液体，并加入0.15mol/L的PBS溶液震荡摇匀；
S14：重复S13多次，得到初始菌液。


3.根据权利要求2所述单细胞分离快速筛选方法，其特征在于，所述S11中，土壤匀浆离心过程是在630×g和4℃条件下离心15min。


4.根据权利要求2所述单细胞...

【专利技术属性】
技术研发人员：沈超峰，刘泽钒，徐丰俊，陈柯蓁，符玉龙，
申请(专利权)人：浙江大学，
类型：发明
国别省市：浙江;33