一种对阿糖胞苷耐药的稳转重组B淋巴细胞白血病细胞系的构建方法及其应用技术

本发明专利技术公开了一种对阿糖胞苷耐药的稳转重组B淋巴细胞白血病细胞系的构建方法及其应用。实验证明，利用RNA干扰技术抑制白血病细胞中肿瘤抑制因子BACH2的表达，可抑制B‑ALL细胞发生凋亡，并降低白血病细胞对化疗药物的敏感性，增加白血病细胞对阿糖胞苷的耐药性。本发明专利技术为白血病研究提供了一个对阿糖胞苷耐药的稳转重组B淋巴细胞白血病细胞系，该细胞系的建立有望为白血病耐药研究提供一个细胞系模型，在医学研究领域具有十分广阔的应用前景。

【技术实现步骤摘要】
一种对阿糖胞苷耐药的稳转重组B淋巴细胞白血病细胞系的构建方法及其应用
本专利技术涉及生物医药
，具体涉及一种对阿糖胞苷耐药的稳转重组B淋巴细胞白血病细胞系的构建方法及其应用。
技术介绍
BTB与CNC同源蛋白2(BTBandCNChomology2，BACH2)是B细胞特异性转录因子，由BACH2基因编码，在B细胞定向发育过程中发挥关键作用。在淋巴祖细胞阶段，BACH2抑制髓系发育程序，推动祖细胞向B细胞分化。在前B细胞阶段，BACH2与BCL6竞争性调控基因的启动子区，对B细胞进行阴性选择。在随后的B细胞成熟阶段，BACH2与BCL6进一步协作阻止B细胞向浆细胞分化，并调节人类体细胞高度突变和类别转换重组。近年研究表明，BACH2尚参与T细胞介导的免疫反应及T细胞静息状态的维持。由此可见，BACH2在淋巴细胞发育及分化过程中发挥重要的调节作用。白血病是一类造血干细胞恶性克隆性疾病。由于分化障碍、增殖失控、凋亡受阻等机制，恶性细胞在骨髓及其他造血组织中大量增殖，引起骨髓微环境改变，从而引发严重的临床症状及并发症。其中，急性淋巴细胞白血病(acutelymphoblasticleukemia，ALL)是儿童时期最常见的恶性肿瘤和主要死亡原因之一。随着联合化疗及支持疗法的应用，儿童ALL的治愈率在我国已达80％以上。尽管如此，白血病耐药和复发使得儿童ALL治疗进入瓶颈期，总体治愈率无明显提高。其中，最主要的原因之一是白血病发病与复发耐药机制不明。目前，儿童白血病的耐药与复发率高达15％-20％左右，已成为影响白血病患儿康复的最关键因素，不仅给患儿本身、而且给家庭及社会带来了不可弥补的严重伤害和不和谐因素。在儿童白血病化疗方案中，阿糖胞苷(cytarabine，Ara-C)是一种作用于细胞S增殖期的嘧啶类抗代谢药物，通过抑制细胞DNA合成干扰细胞增殖。阿糖胞苷主要用于急性白血病，对急性粒细胞白血病、急性淋巴细胞白血病及急性单核细胞白血病均有疗效，并在这些疾病的治疗方案中属于诱导化疗的核心药物。尽管如此，长时间、大剂量应用阿糖胞苷容易使患儿出现耐药反应；此外，高危亚型的白血病患儿由于肿瘤恶性程度高，极易发生耐药反应与疾病复发，严重影响了白血病化疗方案的疗效与疾病转归。
技术实现思路
本专利技术首先提供了抑制BACH2蛋白活性的物质或降低BACH2蛋白含量的物质或沉默或敲除或突变BACH2基因的物质或抑制BACH2基因表达的物质的新用途。本专利技术提供了抑制BACH2蛋白活性的物质或降低BACH2蛋白含量的物质或沉默或敲除或突变BACH2基因的物质或抑制BACH2基因表达的物质在如下a1)-a3)中任一种中的应用：a1)制备抑制白血病细胞凋亡的产品；a2)制备降低白血病细胞对化疗药物的敏感性的产品；a3)制备增加白血病细胞对化疗药物的耐药性的产品。本专利技术又提供了一种产品，其活性成分为抑制BACH2蛋白活性的物质或降低BACH2蛋白含量的物质或沉默或敲除或突变BACH2基因的物质或抑制BACH2基因表达的物质；所述产品的功能为如下b1)-b3)中任一种：b1)抑制白血病细胞凋亡；b2)降低白血病细胞对化疗药物的敏感性；b3)增加白血病细胞对化疗药物的耐药性。上述任一所述应用或产品中，所述抑制白血病细胞凋亡为降低白血病细胞早期凋亡比例和/或晚期凋亡比例。本专利技术还提供了上述抑制BACH2蛋白活性的物质或降低BACH2蛋白含量的物质或沉默或敲除或突变BACH2基因的物质或抑制BACH2基因表达的物质在制备白血病耐药细胞中的应用。本专利技术最后提供了一种白血病耐药细胞的制备方法。本专利技术提供的白血病耐药细胞的制备方法包括如下步骤：抑制目的白血病细胞中BACH2蛋白的活性或降低目的白血病细胞中BACH2蛋白的含量或沉默或敲除或突变目的白血病细胞中的BACH2基因或抑制目的白血病细胞中BACH2基因的表达，得到重组白血病细胞；所述重组白血病细胞对化疗药物的耐药性高于所述目的白血病细胞。上述方法中，所述重组白血病细胞对化疗药物的耐药性高于所述目的白血病细胞体现在所述重组白血病细胞的早期凋亡比例和/或晚期凋亡比例低于所述目的白血病细胞和/或所述重组白血病细胞对化疗药物的IC50高于所述目的白血病细胞。上述任一所述应用或产品或方法中，所述抑制BACH2蛋白活性的物质或降低BACH2蛋白含量的物质可为本领域技术人员公知的任一种可抑制BACH2蛋白合成或促进BACH2蛋白降解或抑制BACH2蛋白功能的物质，如蛋白质(如BACH2抗体)、多肽或小分子化合物(如BACH2抑制剂)等。所述沉默或敲除或突变BACH2基因的物质或抑制BACH2基因表达的物质可为本领域技术人员公知的任一种可使BACH2基因表达量降低或使BACH2基因发生缺失突变或插入突变或碱基替换的物质，如核酸分子(如miRNA、siRNA、dsRNA、shRNA等)或CRISPR/Cas9系统等。在本专利技术的实施例中，所述抑制BACH2基因表达的物质为靶向肿瘤抑制因子BACH2的慢病毒介导的shRNA质粒，具体为靶向肿瘤抑制因子BACH2的Lenti-BACH2-shRNA-1质粒或Lenti-BACH2-shRNA-2质粒。上述任一所述应用或产品或方法中，所述化疗药物为阿糖胞苷。上述任一所述应用或产品或方法中，所述白血病细胞为人B淋巴细胞白血病细胞。进一步的，所述人B淋巴细胞白血病细胞为细胞系来源的人B淋巴细胞白血病细胞。更进一步的，所述细胞系来源的人B淋巴细胞白血病细胞为人B淋巴细胞白血病细胞系Nalm-6。上述任一所述应用或产品或方法中，所述BACH2蛋白的氨基酸序列为序列表中的序列1，所述BACH2基因的核苷酸序列为序列表中的序列2。按照上述方法制备得到的白血病耐药细胞也属于本专利技术的保护范围。按照上述方法制备得到的白血病耐药细胞在白血病耐药研究中的应用也属于本专利技术的保护范围。按照上述方法制备得到的白血病耐药细胞在筛选治疗或辅助治疗白血病的药物中的应用也属于本专利技术的保护范围。本专利技术利用慢病毒介导的shRNA质粒Lenti-BACH2-shRNA-1或Lenti-BACH2-shRNA-1，建立了稳转重组白血病细胞Nalm-6/BACH2KD-1及Nalm-6/BACH2KD-2。WesternBlot检测稳转重组白血病细胞Nalm-6/BACH2KD-1、Nalm-6/BACH2KD-2和对照组细胞中的BACH2表达水平结果表明：Nalm-6/BACH2KD-1及Nalm-6/BACH2KD-2中的肿瘤抑制因子BACH2表达水平明显低于对照组。流式细胞仪检测稳转重组白血病细胞系Nalm-6/BACH2KD-2与对照组细胞的早晚期凋亡水平结果表明：经NS处理后，Nalm-6/BACH2KD-2和对照组细胞的早期凋亡比例分别为1.85％和2.17％；晚期凋亡比例分别为1.45％和3.44％，总体凋亡比例分别为3本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.抑制BACH2蛋白活性的物质或降低BACH2蛋白含量的物质或沉默或敲除或突变BACH2基因的物质或抑制BACH2基因表达的物质在如下a1)-a3)中任一种中的应用：/na1)制备抑制白血病细胞凋亡的产品；/na2)制备降低白血病细胞对化疗药物的敏感性的产品；/na3)制备增加白血病细胞对化疗药物的耐药性的产品。/n

【技术特征摘要】
1.抑制BACH2蛋白活性的物质或降低BACH2蛋白含量的物质或沉默或敲除或突变BACH2基因的物质或抑制BACH2基因表达的物质在如下a1)-a3)中任一种中的应用：
a1)制备抑制白血病细胞凋亡的产品；
a2)制备降低白血病细胞对化疗药物的敏感性的产品；
a3)制备增加白血病细胞对化疗药物的耐药性的产品。


2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：所述抑制白血病细胞凋亡为降低白血病细胞早期凋亡比例和/或晚期凋亡比例。


3.一种产品，其活性成分为抑制BACH2蛋白活性的物质或降低BACH2蛋白含量的物质或沉默或敲除或突变BACH2基因的物质或抑制BACH2基因表达的物质；所述产品的功能为如下b1)-b3)中任一种：
b1)抑制白血病细胞凋亡；
b2)降低白血病细胞对化疗药物的敏感性；
b3)增加白血病细胞对化疗药物的耐药性。


4.根据权利要求3所述的产品，其特征在于：所述抑制白血病细胞凋亡为降低白血病细胞早期凋亡比例和/或晚期凋亡比例。


5.权利要求1中所述的抑制BACH2蛋白活性的物质或降低BA...

【专利技术属性】
技术研发人员：张寒，冯敏，
申请(专利权)人：中国医学科学院医学生物学研究所，
类型：发明
国别省市：云南;53