一种接合转移增强液及其在提高细菌接合转移效率中的应用制造技术

本发明专利技术公开了一种接合转移增强液及在提高细菌接合转移效率中的应用，所述应用是：在50‑60℃下，将接合转移增强液加入接合转移平板中，接种受体菌和供体菌进行接合转移。本发明专利技术的接合转移增强液可显著提高质粒和转座子的接合转移，效率高，转座子的转移效率从0.3×10

【技术实现步骤摘要】
一种接合转移增强液及其在提高细菌接合转移效率中的应用(一)
本专利技术涉及一种接合转移增强液及其在提高细菌接合转移效率中的应用。(二)
技术介绍
水平基因转移是生物进化中主要和持续的动力之一。水平基因转移又称侧向基因转移，是指生物将遗传物质传递给其他细胞而非其子代的过程。然而，这种转移并非毫无限制，而是有一定的障碍。原核生物中水平基因转移主要是通过转化、接合转移和转导3种机制来实现的。转化是指原核生物从环境中摄取裸露DNA片段的过程，不需要受体和供体细胞的物理接触，因此在自然界中转化不是主要的基因转移方式。转导是由病毒介导的细胞间进行遗传转移的一种方式，是指一个细胞的DNA或RNA通过病毒载体的感染转移到另一个细胞中。转导过程中，裸露DNA不能完成转导，不同于转化或接合过程。接合转移是细菌之间通过直接或间接接触，交换DNA的过程。在自然条件下很多质粒或转座子都可通过细菌接合作用转移到新的宿主内，从而赋予宿主新的表型特征。比如在自然环境中细菌获得抗生素抗性基因，一方面是由于抗生素过度使用和滥用产生的抗生素选择压力造成细菌产生抗生素抗性突变；另一方面是细菌通过水平转移的方式获得抗生素抗性基因，后者是细菌获得耐药性的主要方式。细菌抗生素抗性基因往往编码在可移动元件(质粒和转座子等)上，通过接合转移在细菌间进行传播。接合转移对细菌耐药基因快速扩散起到了至关重要作用。细菌接合是一个复杂的DNA转移过程，包括：转移起始位点缺刻、DNA转移的起始、双链分离、单链转移、供体受体互补链的合成及再环化等。细菌的接合转移受自身和外界因素影响：①供体菌和受体菌的生长状态、配比关系和接合时间；②细胞表面分子；③抗生素的使用；④金属离子；⑤纳米材料。虽然转化在分子生物学领域中应用很广泛，但不是所有的菌株都适用转化操作的，特别是革兰氏阳性细菌，转化的效率很低。接合转移也是微生物学和分子生物学领域研究中非常重要的技术手段，比如在研究细菌耐药基因是否通过横向水平转移方式进行传播，从而来评价其在环境中的传播，因此在实验室条件下研究其接合转移事件为耐药基因的控制和预防提供科学依据；在遗传操作中，将工程质粒(敲除用自杀质粒和克隆表达质粒等)从供体细胞导入受体细胞是关键步骤，这个过程往往会采用接合转移的方式将工程质粒导入受体细胞，这种方式对受体细胞的损伤是最小的；在分子生物学研究中，构建随机插入突变文库是常用的大规模筛选的操作技术，而接合转移是转座子导入受体细胞的关键手段等。因此，接合转移效率的高低直接关系着对耐药基因的传播研究、遗传操作技术的进行和随机插入突变文库的构建。总之，接合转移不管是实验室基础研究还是应用研究中都有着很好的发展前景和商业价值。接合转移在微生物学和分子生物学领域，特别是遗传操作上应用特别广泛，比如研究抗性基因的横向水平转移，随机插入突变文库的构建等，但是在现有的技术上，接合转移的效率普遍不是很高，往往达不到理想的效果。尽管目前有些研究发现可以提高接合转移效率比如添加抗生素、金属离子和使用纳米材料，但是这些方法普遍只适合质粒的转移，适用范围窄；抗生素的使用成本比较高，不环保而且使用时对菌株的生长影响大；金属离子使用的是重金属离子，不环保，使用容易受培养基的成分影响，对菌株的损伤比较大，而且金属离子促进大质粒接合转移，不清楚是否也适合工程质粒(工程质粒一般比较小<10kb)和转座子介导的接合转移；纳米材料使用的是特殊材质，成本高而且不环保，操作复杂，使用后容易造成环境污染等。(三)
技术实现思路
本专利技术目的是提供一种接合转移增强液及其在提高细菌接合转移效率中的应用，成本低，使用量少，在环境中易分解；而且该增强液可明显提高接合转移效率，可提高十倍以上；适用范围广，不管是自然质粒的转移还是随机突变文库的构建都能明显提高。本专利技术采用的技术方案是：本专利技术提供一种接合转移增强液，所述增强液是由二甲基亚砜与甘油和甲醇以体积比(10-200):5:2混合而成，优选20:5:2。本专利技术还提供一种所述接合转移增强液在提高细菌接合转移效率中的应用，所述应用是在50-60℃下，将接合转移增强液加入接合转移平板(供体菌株和受体菌株都能生长的培养基平板)中，再进行接合转移。进一步，所述接合转移包括质粒或转座子的接合转移。进一步，所述接合转移增强液体积加入量以接合转移平板体积计为0.01-1.0％，优选0.025％。进一步，所述质粒接合转移包括随机插入突变文库的构建，具体优选为：以含庆大霉素抗性的E.coliWM3064/pBTK30菌体为供体菌，以铜绿假单胞菌PAO1菌体为受体菌，用LB培养基充分悬浮制成菌悬液；取菌悬液加入接合转移平板上，37℃培养箱中静置共培养6h，用LB培养基将接合转移后的混合菌体全部洗涤下来，将洗脱下来的菌液接种至LB+25μg/ml庆大霉素平板上，37℃培养箱中静置共培养，长出的菌株即为含庆大霉素抗性的铜绿假单胞菌；所述接合转移平板是在50-60℃下，向灭菌的LB培养基中加入终浓度0.2mg/ml的DAP，再加入接合转移增强液，充分混匀后倒平板；所述接合转移增强液加入量以含终浓度0.2mg/ml的DAP的LB培养基体积计为0.01-1.0％进一步，所述供体菌按如下方法制备：将E.coliWM3064/pBTK30接种于含200μg/mlDAP+15μg/ml庆大霉素的LB培养基，37℃的摇床培养箱(180rmp)中培养至对数期(OD600≈1.0)时，6500rpm离心5min，用质量浓度0.85％NaCl水溶液洗涤两次，收集E.coliWM3064/pBTK30菌体。进一步，所述受体菌安如下方法制备：将铜绿假单胞菌PAO1接种于LB培养基中，置于37℃的摇床培养箱(180rmp)中培养至对数期(OD600≈1.0)时，6500rpm离心5min，用质量浓度0.85％NaCl水溶液洗涤两次，收集铜绿假单胞菌PAO1菌体。本专利技术所述转座子接合转移是指：转座子是一类在细菌的染色体、质粒或噬菌体之间自行移动的遗传成分，是基因组中一段特异的具有转位特性的独立的DNA序列。能在不同的宿主细胞之间通过接合转移的方式进行转移的转座子被称为接合性转座子。比如双歧杆菌DSM21854中的红霉素抗性基因erm可以通过接合性转座子转移至另一株双歧杆菌DSM20211中，即以编码红霉素抗性基因erm的双歧杆菌DSM21854菌体为供体菌，以编码四环素抗性基因tet的双歧杆菌DSM20211菌体为受体菌，加入M58液体培养基，混匀，制成菌悬液；分别取100μl菌悬液滴在接合转移平板上，37℃厌氧工作站中共培养24h，用M58液体培养基将平板上的菌体洗涤下来，离心，收集接合转移后的菌体，分别涂布于M58培养基+8μg/ml四环素+15μg/ml红霉素，37℃厌氧工作站中倒置培养48h，获得同时含红霉素抗性基因erm和四环素抗性基因tet的双歧杆菌DSM20211菌体；所述接合转移平板是含0.25μl/ml接合增强液的M58培养基。本专利技术方法还适用于涉及细菌之间的耐药基因或者功能基因本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种接合转移增强液，其特征在于所述增强液是由二甲基亚砜与甘油和甲醇以体积比10-200:5:2混合而成。/n

【技术特征摘要】
1.一种接合转移增强液，其特征在于所述增强液是由二甲基亚砜与甘油和甲醇以体积比10-200:5:2混合而成。


2.一种权利要求1所述接合转移增强液在提高细菌接合转移效率中的应用。


3.如权利要求2所述的应用，其特征在于所述应用是：在50-60℃下，将接合转移增强液加入接合转移平板中，接种受体菌和供体菌进行接合转移。


4.如权利要求3所述的应用，其特征在于所述接合转移包括质粒或转座子的接合转移。


5.如权利要求3所述的应用，其特征在于所述接合转移增强液体积加入量以接合转移平板体积计为0.01-1.0％。


6.如权利要求4所述的应用，其特征在于所述质粒接合转移为随机插入突变文库的构建，所述随机插入突变文库的构建方法为：以含庆大霉素抗性的E.coliWM3064/pBTK30菌体为供体菌，以铜绿假单胞菌PAO1菌体为受体菌，用LB培养基充分悬浮制成菌悬液；取菌悬液加入接合转移平板上，37℃培养箱中静置共培养6h，用LB培养基将接合转移后的混合菌体全部洗涤下来，将洗脱下来的菌液接种至LB+25μg/ml庆大霉素平板上，37℃培养...

【专利技术属性】
技术研发人员：李百元，尹业师，陈华海，曹林艳，胡云霏，陈丹，
申请(专利权)人：湖南科技学院，
类型：发明
国别省市：湖南;43