登革病毒抗原的快速检测试纸制造技术

本发明专利技术公开了登革病毒抗原的快速检测试纸，将登革病毒DENV1和DENV3的NS1重组蛋白分别免疫小鼠，采取捕获法交叉筛选的方式获得分泌单克隆抗体的杂交瘤细胞株，将登革病毒NS1单克隆抗体用于制备登革病毒抗原的快速检测试纸，该试纸可以检测出四种不同血清型的登革热病毒。

【技术实现步骤摘要】
登革病毒抗原的快速检测试纸
本专利技术属于生物
，具体涉及登革病毒NS1单克隆抗体及其制备方法，以及基于该抗体的检测试纸。
技术介绍
登革热是一种急性虫媒传染病，由登革热病毒经由蚊虫叮咬传播给人，可引起登革热和重症登革热，主要通过埃及伊蚊和白纹伊蚊传播。其典型的临床表现为起病急骤，高热，头痛，肌肉、骨关节剧烈酸痛，部分患者出现皮疹、出血倾向、淋巴结肿大、白细胞计数减少、血小板减少等。该病主要在热带及亚热带地区流行，我国的广东、香港、澳门等地是登革热流行区，一般在每年的5～11月份，高峰在7～9月份流行。根据其包膜蛋白的抗原特异性差异，将登革病毒分为四种血清型(DENV1～DENV4)。登革NS1蛋白是登革病毒的一种重要的非结构蛋白，对登革病毒的测序结果显示，NS1在登革病毒各型别间具有高度保守性，其氨基酸同源型为70％。因此利用该蛋白制备的同一株单克隆抗体可以检测出不同血清型的登革病毒。目前检测试剂的一个问题在于快速诊断试剂的局限性，有一些临床样本的病毒含量极低，低于快诊试纸的检测限，无法检出；另一个问题在于有些试剂不能测出全部四种血清型，会有漏检的情况出现。
技术实现思路
本专利技术的目的之一是提供登革病毒NS1单克隆抗体及其制备方法：将登革病毒DENV1和DENV3的NS1重组蛋白分别免疫小鼠，取其脾脏细胞，并分别与SP2/0骨髓瘤细胞融合后制备杂交瘤细胞，DENV1型NS1蛋白免疫的融合细胞采用DENV2和DENV3型的NS1重组蛋白进行筛选，DENV3型NS1蛋白免疫的融合细胞采用DENV1和DENV4型NS1重组蛋白进行筛选，获得2株分泌单克隆抗体的杂交瘤细胞株，将筛选出的杂交瘤细胞分别注射至石蜡油致敏的小鼠腹腔中，取小鼠腹水，腹水抗体经纯化后即为登革病毒NS1单克隆抗体，分别标记为1号、2号抗体，。在本专利技术的一个优选方案中，NS1重组蛋白的制备方法为：将合成的登革病毒DENV1～DENV4型的NS1基因序列分别插入含有S-tag标签的pCDNA3.1载体的多克隆位点，构建重组表达载体，瞬时转染293F细胞，提取纯化NS1重组蛋白。本专利技术的另一个目的是提供登革病毒NS1单克隆抗体在制备检测登革病毒抗原试剂中的应用。在本专利技术的一个优选方案中，登革病毒抗原的快速检测试纸包括样品垫、胶体金垫、NC膜、吸收垫、底板，胶体金垫含有2号抗体，NC膜的测试线含有1号抗体，NC膜的质控线含有羊抗鼠IgG多抗。本专利技术具有以下优点：1、以这种方法筛选出的杂交瘤细胞制备的单克隆抗体不仅保有良好的亲和力及特异性，组合形成的快速检测试纸可以检测出四种不同血清型的登革热病毒。2、制备的真核抗原上带有S-tag标签，筛选时采取S-tag单抗标记辣根酶进行检测。以标签蛋白为检测信号，不会占用抗体与抗原的结合位点，可以筛选到位点更丰富的单克隆抗体。附图说明图1为pcDNA3.1质粒的图谱。图2为胶体金试纸的结构示意图。图3为登革热病毒抗原快速检测试纸的结果判断标准。具体实施方式以下实施例以举例的方式描述本方明，其不应视为对本专利技术的限制。所使用的实验材料如无特别说明，均为市售购买。实施例1真核抗原的制备登革热病毒DENV1～4型的(基因序列：1型FJ024463.1，2型GQ868598.1，3型MH134592.1，4型NC_002640.1)，经上海生工合成后双酶切(XhoI/BamHI)分别插入改造后的pCDNA3.1载体多克隆位点构建含有登革热NS1序列的重组表达载体pCDNA3.1/S-NS1。1、质粒DNA的大量制备按照QIAGEN公司生产的QIAGENPlasmidMaxiKit的步骤，提取重组质粒DNA，将所得DNA溶于TE溶液，测定所制备的质粒DNA的OD260值和OD280值，按照计算DNA的纯度及浓度的公式算出DNA的纯度和浓度，置-20℃冰箱保存备用。2、真核抗原的表达纯化抗原的表达：大量转染所用转染试剂为PEI，将重组质粒转染悬浮细胞293F，转染前一天将细胞密度调整至6×104个/mL，取40mL细胞于125mL细胞培养锥形摇瓶中，待第二天细胞密度达1×105个/mL左右时进行转染；取50mg质粒于14mL尖底离心管中；加4mLD-PBS，轻轻混匀三次，每次隔6s；加120μLPEI(1mg/mL)，按上述方法混匀，静置20-30min；滴加至细胞摇瓶中，继续培养直至收样。转染后每天可取细胞上清，ELISA法检测蛋白表达量，同时检测活细胞比率，选择表达量较高一天进行收样。纯化：取5mL左右的S-tag填料与表达目的蛋白的细胞培养上清及裂解液进行结合，4℃旋转混匀2h以上。手动过柱，分别收集填料与滤穿液，使用约10倍柱体积的BindingWashBuffer，洗柱。加一定体积的3MMgCl2于填料中洗脱目的蛋白，静置10min，500×g离心5min。收集洗脱液，重复洗脱五次。将填料重新加至滤穿液中再次进行结合与纯化，纯化两到三次即可。实施例2鼠抗登革病毒抗原单克隆抗体的制备1、免疫方法及程序本实验所使用的免疫原是由登革热NS1重组蛋白与佐剂混合乳化而制成。取0.2mLNS1蛋白(1mg/mL)，加PBS稀释至200μg/mL，然后取等体积CFA或IFA佐剂，用双通针头注射器反复混合充分乳化，制成白色乳糜状的油包水稳定相态。室温下静置半小时不分层，放一滴于水面上呈小油滴状，表明乳化成功可用于注射，否则需重新乳化。采用8周龄雌性Balb/c小鼠进行免疫，挑选9只健康小鼠，随机分成3组，每组3只。三组小鼠分别延后一周免疫，其中后2组作为备用。免疫剂量为50μg蛋白/只小鼠。免疫注射途径采用腹腔内注射。免疫的时间间隔为2周。首次免疫使用CFA乳化的抗原，后续免疫使用IFA乳化的抗原，最后的加强免疫直接使用NS1重组蛋白。在第3次免疫后开始检测小鼠抗血清效价，一般在免疫注射后的第十天进行，当效价符合预期要求后，立即用非乳化的抗原加强免疫一次，于3天后取脾脏进行细胞融合实验。2、杂交瘤细胞株制备融合前的2周左右，从液氮罐中解冻复苏SP2/0骨髓瘤细胞，用含10％小牛血清的RPMI1640完全培养基培，置于37℃，5％CO2的细胞培养箱中培养，使细胞大量增殖，当细胞生长面积达80％以上时可进行传代培养，使细胞始终处于对数生长期，并及时观察，确保细胞处于生长旺盛、形态正常的健康状态。为确保SP2/0细胞对HAT的敏感性，应在融合前使用8-氮鸟嘌呤处理细胞一次。融合前用0.4％台盼蓝染色计数，取活细胞数大于95％，生长面积达90％以上的三个T25瓶细胞，三瓶细胞数量约为2-3×107个。将三瓶细胞收集到一个离心管中，离心后弃去上清，用RPMI1640不完全培养基重悬细胞沉淀，并用RPMI1640不完全培养基重复洗涤2次，最后重悬于20mL无血清RPMI1640培养液中，并进行细胞计数后用于下步的细胞融合本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.登革病毒NS1单克隆抗体，其特征在于，由下述方法制备而成：/n(1)将登革病毒DENV1和DENV3的NS1重组蛋白分别免疫小鼠；/n(2)取其脾脏细胞，并分别与SP2/0骨髓瘤细胞融合后制备杂交瘤细胞，DENV1型NS1蛋白免疫的融合细胞采用DENV2和DENV3型的NS1重组蛋白进行筛选，DENV3型NS1蛋白免疫的融合细胞采用DENV1和DENV4型NS1重组蛋白进行筛选，获得2株分泌单克隆抗体的杂交瘤细胞株,分别标记为1号、2号抗体；/n(3)将筛选出的杂交瘤细胞分别注射至石蜡油致敏的小鼠腹腔中，取小鼠腹水，腹水抗体经纯化后即为登革病毒NS1单克隆抗体。/n

【技术特征摘要】
1.登革病毒NS1单克隆抗体，其特征在于，由下述方法制备而成：
(1)将登革病毒DENV1和DENV3的NS1重组蛋白分别免疫小鼠；
(2)取其脾脏细胞，并分别与SP2/0骨髓瘤细胞融合后制备杂交瘤细胞，DENV1型NS1蛋白免疫的融合细胞采用DENV2和DENV3型的NS1重组蛋白进行筛选，DENV3型NS1蛋白免疫的融合细胞采用DENV1和DENV4型NS1重组蛋白进行筛选，获得2株分泌单克隆抗体的杂交瘤细胞株,分别标记为1号、2号抗体；
(3)将筛选出的杂交瘤细胞分别注射至石蜡油致敏的小鼠腹腔中，取小鼠腹水，腹水抗体经纯化后即为登革病毒NS1单克隆抗体。

【专利技术属性】
技术研发人员：严兵，
申请(专利权)人：武汉科源安博生物技术有限公司，
类型：发明
国别省市：湖北;42