一种人促卵泡激素及其体外重组装方法技术

本发明专利技术公开了一种人促卵泡激素及其体外重组装方法，属于生物医药与基因工程技术领域。本发明专利技术提供的人促卵泡激素是将FSHα和FSHβ亚基基因分别在动物乳汁中表达后，在体外重组装获得，具有与Gonal‑F等同的生物学功能。制备方法包括构建人FSHα和FSHβ基因表达载体，将人FSHα和FSHβ亚基的表达在动物乳汁中，进行体外重组装获得具备生物学活性的人促卵泡激素，本发明专利技术可以避免有生物活性的内源FSH在动物体内的积聚，从而降低由于大量生物活性FSH的积累导致的动物患肿瘤的风险。

【技术实现步骤摘要】
一种人促卵泡激素及其体外重组装方法
本专利技术涉及生物医药与基因工程
，特别是涉及一种人促卵泡激素及其体外重组装方法。
技术介绍
人促卵泡生长激素(hFSH)是由下丘脑控制的垂体前叶嗜碱性细胞合成和分泌的糖蛋白类促性腺激素，它是一种由FSHα亚基与FSHβ亚基通过非共价键结合形成的异源二聚体糖蛋白。其中FSHα亚基基因编码了92个氨基酸，包含10个半胱氨酸，形成5个二硫键；FSHβ亚基基因编码了111个氨基酸，其中包含12个半胱氨酸，形成6个二硫键。人促卵泡生长激素在女性体内的主要功能是促进子宫内膜的生长、卵泡的发育和排卵等，hFSH在临床上主要用于治疗女性不孕不育。随着人类生活环境的日益恶化，hFSH的需求量越来越大。市面上主要有两种人促卵泡生长激素产品，一种是尿源的人促卵泡生长激素，另外一种是国外进口的基因工程重组人促卵泡生长激素(人促卵泡激素)蛋白，其中在国内市场的临床应用上进口重组人促卵泡生长激素占据主要市场。进口的重组促卵泡生长激素目前主要是利用基因工程技术和细胞培养工艺来制备重组促卵泡激素生物制品，如瑞士Serono公司的Gonal-F以及荷兰Organon公司的Puregon等进口的人促卵泡激素都是这类产品。然而细胞产生人促卵泡激素虽然生物活性好，纯度高，但是产量相对较低，使得这种方法制备的人促卵泡激素产品价格昂贵。动物乳腺生物反应器被视为是一种更加优良的方法用于制备药物蛋白，具备产量高、价格低的优势。但是研究表明内源性的FSH在动物体内积聚过多，可能导致动物一系列的疾病，比如卵巢癌和乳腺癌，这是目前利用动物乳腺生物反应器制备人促卵泡激素最大的障碍。因此，探究一种避免在动物体内产生大量有生物活性的内源性FSH的方法是很有必要的，这能降低转基因动物因为内源性FSH的过多而患肿瘤的风险，同时又可以通过动物乳腺生物反应器制备大量人促卵泡激素。
技术实现思路
为了解决内源性FSH大量积累在动物体内的问题，本专利技术提供了一种人促卵泡激素，所述人促卵泡激素是FSHα和FSHβ亚基基因分别在动物乳汁中表达后，在体外重组装获得。在本专利技术的一种实施方式中，FSHα、FSHβ亚基基因分别在动物乳汁中表达是将Ad-FSHα、AdE-FSHβ腺病毒分别注入到动物乳腺内进行表达。在本专利技术的一种实施方式中，所述Ad-FSHα、Ad-FSHβ腺病毒是将FSHα基因表达载体和FSHβ基因表达载体分别转染腺病毒包装细胞获得。在本专利技术的一种实施方式中，所述FSHα基因表达载体和FSHβ基因表达载体是将FSHα亚基基因和FSHβ亚基基因分别克隆到pAdTrack-CMV中构建pAdTrack-CMV-FSHα和pAdTrack-CMV-FSHβ腺病毒穿梭载体，将pAdTrack-CMV-FSHα和pAdTrack-CMV-FSHβ穿梭载体分别与骨架载体pAdEasy-1转化到非同一大肠杆菌体内重组获得。本专利技术还提供了一种体外重组装制备人促卵泡激素的方法，FSHα亚基与FSHβ亚基蛋白在体外重新组装，得到重组人促卵泡激素，包括以下步骤：(1)构建人FSHα和FSHβ基因表达载体以pAdTrack-CMV为穿梭载体，将人FSHα、FSHβ亚基基因分别克隆到pAdTrack-CMV中构建pAdTrack-CMV-FSHα和pAdTrack-CMV-FSHβ腺病毒穿梭载体，将pAdTrack-CMV-FSHα和pAdTrack-CMV-FSHβ穿梭载体分别与骨架载体pAdEasy-1转化到非同一大肠杆菌体内重组，获得重组腺病毒表达载体pAd-FSHα和pAd-FSHβ；(2)人FSHα和FSHβ亚基的表达将pAd-FSHα和pAd-FSHβ分别转染到腺病毒包装细胞中收获Ad-FSHα腺病毒和Ad-FSHβ腺病毒，收获的所述Ad-FSHα腺病毒和Ad-FSHβ腺病毒分别注入到非同一动物的乳腺中，获得含有FSHα亚基蛋白的动物乳汁和含有FSHβ亚基蛋白的动物乳汁；(3)体外组装人FSHα和FSHβ亚基蛋白将含有FSHα亚基蛋白的动物乳汁和含有FSHβ亚基蛋白的动物乳汁混合，使FSHα亚基蛋白和FSHβ亚基蛋白在体外进行组装，组装后收集蛋白样品，得到体外重新组装的人促卵泡激素。在本专利技术的一种实施方式中，步骤(2)中所述的动物乳汁中的FSHα亚基和FSHβ亚基蛋白不具备生物学活性。在本专利技术的一种实施方式中，步骤(2)中所述动物乳腺为活体牛的乳腺或者活体羊的乳腺。在本专利技术的一种实施方式中，步骤(3)中将含有FSHα亚基蛋白的动物乳汁和含有FSHβ亚基蛋白的动物乳汁混合，是以目的蛋白含量为1:1的浓度进行混合，体外重组装。在本专利技术的一种实施方式中，步骤(3)中所述的FSHα亚基蛋白和FSHβ亚基蛋白体外组装是在2℃-8℃下经过24h-96h组装。在本专利技术的一种实施方式中，步骤(3)中获得的体外重新组装的人促卵泡激素具备生物活性。在本专利技术的一种实施方式中，所述FSHβ基因中连接有6×Histag，便于后期体外重组装人促卵泡激素的纯化。在本专利技术的一种实施方式中，所述将pAd-FSHα和pAd-FSHβ分别转染到腺病毒包装细胞，其转染方法包括阳离子脂质转染方法。在本专利技术的一种实施方式中，步骤(2)中所述收获的所述Ad-FSHα腺病毒和Ad-FSHβ腺病毒分别注入到动物乳腺中，使用第三代腺病毒感染动物乳腺，第三代腺病毒具备更高的病毒滴度。在本专利技术的一种实施方式中，步骤(2)中表达的人FSHα和FSHβ亚基蛋白为分别在不同的羊乳腺和/或牛乳腺中表达，单独的FSHα亚基蛋白和单独的FSHβ亚基蛋白都不具备生物学活性。在本专利技术的一种实施方式中，步骤(2)中的FSHα和FSHβ亚基蛋白经过Westernblot检测其分子大小分别为18kD和22kD。在本专利技术的一种实施方式中，步骤(3)中组装是在2℃-8℃下组装24-96小时，FSHα亚基蛋白分子和FSHβ亚基蛋白分子自组装成完整的人促卵泡激素。本专利技术有益效果在于：(1)本专利技术的创新在于利用腺病毒在羊、牛乳腺中高效表达了没有生物活性的FSHα和FSHβ亚基蛋白，这让动物体内不会积累有生物活性的FSH，可以潜在降低因为内源活性FSH积累给动物带来的致病风险。(2)无生物活性的FSHα亚基和FSHβ亚基在体外重新组装成有生物活性的人促卵泡激素，这种方法可以利用无活性的FSHα亚基和FSHβ亚基蛋白在体外制备出人促卵泡激素，可以利用转基因动物乳腺生物反应器制备大量人促卵泡激素。(3)本专利技术的人促卵泡激素经过体内体外生物活性试验验证，具有与Gonal-F相当的生物学功能。附图说明图1Westernblot鉴定羊乳腺和牛乳腺表达的FSHα亚基蛋白Anti-FSHα为检测羊乳腺和牛乳腺表达的FSHα亚基蛋白的单克隆抗体；FSHα-G为羊乳腺表达的FSHα亚基蛋白，分子量大小约为18kD；FS本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种人促卵泡激素，其特征在于，所述人促卵泡激素是FSHα和FSHβ亚基基因分别在动物乳汁中表达后，在体外重组装获得。/n

【技术特征摘要】
1.一种人促卵泡激素，其特征在于，所述人促卵泡激素是FSHα和FSHβ亚基基因分别在动物乳汁中表达后，在体外重组装获得。


2.根据权利要求1所述的一种人促卵泡激素，其特征在于，FSHα、FSHβ亚基基因分别在动物乳汁中表达是将Ad-FSHα、Ad-FSHβ腺病毒分别注入到非同一动物的乳腺内进行表达。


3.根据权利要求2所述的一种人促卵泡激素，其特征在于，所述Ad-FSHα、Ad-FSHβ腺病毒是将FSHα基因表达载体和FSHβ基因表达载体分别转染腺病毒包装细胞获得。


4.根据权利要求3所述的一种人促卵泡激素，其特征在于，所述FSHα基因表达载体和FSHβ基因表达载体是将FSHα亚基基因和FSHβ亚基基因分别克隆到pAdTrack-CMV中构建pAdTrack-CMV-FSHα和pAdTrack-CMV-FSHβ腺病毒穿梭载体，将pAdTrack-CMV-FSHα和pAdTrack-CMV-FSHβ穿梭载体分别与骨架载体pAdEasy-1转化到非同一大肠杆菌体内重组获得。


5.一种体外重组装制备人促卵泡激素的方法，其特征在于，FSHα亚基与FSHβ亚基蛋白在体外重新组装，得到重组人促卵泡激素，包括以下步骤：
(1)构建人FSHα和FSHβ基因表达载体
以pAdTrack-CMV为穿梭载体，将人FSHα、FSHβ亚基基因分别克隆到pAdTrack-CMV中构建pAdTrack-CMV-FSHα和pAdTrack-CMV-FSHβ腺病毒穿梭载体，将pAdTrack-CMV-FSHα和pAdTrack-CMV-FSHβ穿梭载体分别与骨架载体pAdEasy-1转化到...

【专利技术属性】
技术研发人员：李青旺，华荣茂，刘建喜，胡建宏，
申请(专利权)人：西北农林科技大学，
类型：发明
国别省市：陕西;61