一种测序文库的构建方法技术

一种用于第二代高通量测序文库构建的方法和试剂盒，可提高核酸模板的利用效率，简化测序文库的构建流程，使得测序结果更加准确和覆盖度更加均一。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】一种测序文库的构建方法
本专利技术涉及用于第二代高通量测序文库构建的方法和试剂盒，更具体地，本专利技术涉及3’末端悬随机碱基的测序接头用于高通量测序文库构建的方法和试剂盒。
技术介绍
相对于第一代测序技术，第二代测序技术测序速度更快，通量更高，符合目前科技发展对测序的需求。目前，第二代测序技术的平台主要包括Illumina公司的Hiseq、Miseq、Nextseq、Novaseq以及LifeTechnologies公司的SOLIDsystem、PGM、Proton等。第二代测序技术的技术思路是边合成边测序，即根据新合成的不同碱基带来的信号变化确定DNA序列，比如，Illumina测序平台是检测光信号，Life测序平台是检测酸碱变化引起的电流变化。第二代测序技术是迄今为止发展最为成熟、使用最为广泛的DNA高通量测序手段，在基因组大规模测序和基因诊断治疗中功不可没，其在临床方面的应用也将越来越广泛。循环DNA又称为游离DNA，是血液中在细胞外存在的DNA。游离DNA的主要来源是凋亡细胞或骨髓细胞，这些细胞释放的DNA再经体内核酸酶切割后，产生了长度约为166bp的小片段DNA(Y.M.DennisLoetal.ScienceTranslationalMedicine.2010.10:61ra91)。游离DNA在体内处于一个动态平衡状态，所以，游离DNA可以作为健康评估的一个重要参数。肿瘤发生、器官移植等变化都会导致外周血游离DNA的性质发生改变，这些性质包括游离DNA的长度、碱基信息、表观修饰等；所以，游离DNA可以作为疾病的早期诊断、监测和预后评估的一种无创检测的重要标志物。目前，以游离DNA作为分子标记开展的无创产前诊断临床应用已经获得了全方面认可，多个国家已经全面推进该技术应用。除了碱基信息，游离DNA的长度信息也是一种非常重要的分子标记。有研究发现，不同组织或不同状态细胞的核小体、转录因子或DNA结合蛋白会与DNA的不同区域结合，最终导致游离DNA长度和测序覆盖度发生变化，根据这些差异可以追溯这些游离DNA的来源，这将给癌症早诊、器官移植、监控等领域带来新的曙光(MatthewW.Snyderetal.Cell2016.1:57-68)。另一个方面，利用高通量测序方法对肿瘤甲基化的研究发现，利用甲基化测序分析肿瘤与正常组织的DNA甲基化差异信号后，可以通过此差异实现癌症的早期诊断，再结合不同组织特异的甲基化信号，还可以对肿瘤的具体位置进行定位，这对于癌症早筛后诊治具有重大意义(KunSunetal.2015.5:5503-12；ShichengGuoetal.2017.3:635–642)。利用第二代高通量测序技术对游离DNA进行甲基化测序前，需要先构建甲基化测序文库。目前，第二代高通量甲基化测序文库的传统构建流程(参见图4)是先进行预文库构建，包括末端补平，5’末端磷酸化，3’末端悬A和接头连接步骤；在预文库构建完成后，再进行亚硫酸氢盐处理，亚硫酸氢盐处理会导致大量DNA损伤，最终可以进行测序的模板占原始模板的比例不到10％(MasahikoShiraishietal.2004.10:409-415)。甲基化测序文库的构建流程需要，1)每一步都需要纯化，操作繁琐；2)补平步骤会人为引入核苷酸，改变真实的甲基化状态；3)大量DNA模板在亚硫酸氢盐处理时被破坏，并在PCR扩增后丢失。目前，Swift甲基化测序文库构建方法较传统方法能更高效的建库(CN104395480，参见图5)，构建流程是先进行亚硫酸氢盐处理，再进行文库构建，包括3’末端加尾和接头连接，再进行延伸反应，在得到双链脱氧多核苷酸的基础上，再进行另一端测序接头的连接，因为延伸反应时的DNA模板含有大量的dUTP，加上亚硫酸氢盐处理对DNA模板的损伤，只发生一轮延伸反应，得到完整双链脱氧多核苷酸的效率低，可用于另一端测序接头连接的模板少，最终可以进行测序的模板少。而在基因诊断领域一直需要开发出更优、更高效的建库方法，以提高模板的利用效率。
技术实现思路
鉴于目前基于亚硫酸氢盐处理的DNA甲基化测序文库构建过程中所遇到的问题，本专利技术提供了一种对单链脱氧多核苷酸进行接头连接的方法；并进而提供了一种第二代高通量测序文库构建方法。本专利技术的方法不但适用于正常DNA，还适用于FFPE样本、古DNA、亚硫酸氢盐处理后的DNA样本等损伤严重的样本。本专利技术涉及一种对脱氧多核苷酸底物进行建库的方法，所述方法包括如下步骤：(1)将所述脱氧多核苷酸单链底物与如下物质混合以形成第一混合物：a)选自dGTP、dCTP、dATP和dTTP中的一种脱氧核苷酸；b)末端脱氧核苷酸转移酶和DNA连接酶；c)控尾组分，其中该控尾组分是由5至20个核苷酸长度的多核苷酸同聚物和X区，以及与X区互补的连接子多核苷酸组成的部分双链核苷酸分子；其中多核苷酸同聚物与a)中的脱氧核苷酸互补；(2)孵育所述的第一混合物，脱氧多核苷酸单链底物的3’端与溶液中的脱氧核苷酸发生加尾反应，添加了多核苷酸同聚尾的底物3’端与控尾组分的连接子连接，得到加尾后的底物；(3)在步骤(2)的反应体系中，添加DNA聚合酶、包含dGTP、dCTP、dATP和dTTP的脱氧核苷酸和线性扩增引物，以形成第二混合物；(4)孵育所述第二混合物，以步骤(2)得到的加尾后的底物为模板进行第一次线性延伸反应，合成底物的互补链，再解链，线性扩增引物与底物互补后，再次进行后续的线性延伸反应，其中线性延伸反应的次数不低于3次；(5)使步骤(4)的产物解链；(6)在步骤(5)的溶液中添加5’测序接头和DNA连接酶形成第三混合物；(7)孵育所述的第三混合物，5’测序接头与底物互补链结合，制备得到DNA文库。在一个具体的实施方式，在步骤(4)的第一次线性延伸反应中，所用的引物是控尾分子(也就是控尾区和X区所组成的单链)，后续的延伸反应中，所用的引物为步骤(3)中添加的线性扩增引物。在一个具体的实施方式，在步骤(4)延伸反应开始之前，降解控尾组分中的多核苷酸同聚物和X区片段，以步骤(3)中添加的线性扩增引物针对底物进行线性延伸反应。在一个具体的实施方式，步骤(3)中添加的线性扩增引物对底物进行竞争性结合，从而该添加的线性扩增引物针对底物进行线性延伸反应。本专利技术进一步涉及一种试剂盒，该试剂盒能对脱氧多核苷酸底物进行建库，其包含：组分一：包含选自dGTP、dCTP、dATP和dTTP中的一种脱氧核苷酸、末端脱氧核苷酸转移酶、DNA连接酶和控尾组分，其中所述的控尾组分由5至20个核苷酸长度的多核苷酸同聚物和X区，以及与X区互补的连接子多核苷酸组成的部分双链核苷酸分子，该多核苷酸同聚物与所述的选自dGTP、dCTP、dATP和dGTP中的一种脱氧核苷酸互补；组分二：包含DNA聚合酶、包含dGTP、dCTP、dATP和dTTP的脱氧核苷酸，和线性扩增引物；组分三：包含5’测序接头和DNA连接酶。本专利技术通过设计线性扩增，可有效提高原始单本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种对脱氧多核苷酸底物进行建库的方法，所述方法包括如下步骤：/n(1)将所述脱氧多核苷酸单链底物与如下物质混合以形成第一混合物：a)选自dGTP、dCTP、dATP和dTTP中的一种脱氧核苷酸；b)末端脱氧核苷酸转移酶和DNA连接酶；c)控尾组分，其中该控尾组分是由5至20个核苷酸长度的多核苷酸同聚物和X区，以及与X区互补的连接子多核苷酸组成的部分双链核苷酸分子；其中多核苷酸同聚物与a)中的脱氧核苷酸互补；/n(2)孵育所述的第一混合物，脱氧多核苷酸单链底物的3’端与溶液中的脱氧核苷酸发生加尾反应，添加了多核苷酸同聚尾的底物3’端与控尾组分的连接子连接，得到加尾后的底物；/n(3)在步骤(2)的反应体系中，添加DNA聚合酶、包含dGTP、dCTP、dATP和dTTP的脱氧核苷酸和线性扩增引物，以形成第二混合物；/n(4)孵育所述第二混合物，以步骤(2)得到的加尾后的底物为模板进行第一次线性延伸反应，合成底物的互补链，再解链，线性扩增引物与底物互补后，再次进行后续的线性延伸反应，其中线性延伸反应的次数不低于3次；/n(5)使步骤(4)的产物解链；/n(6)在步骤(5)的溶液中添加5’测序接头和DNA连接酶形成第三混合物；/n(7)孵育所述的第三混合物，5’测序接头与底物互补链结合，制备得到DNA文库。/n...

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】20181011 CN 201811185409X一种对脱氧多核苷酸底物进行建库的方法，所述方法包括如下步骤：
(1)将所述脱氧多核苷酸单链底物与如下物质混合以形成第一混合物：a)选自dGTP、dCTP、dATP和dTTP中的一种脱氧核苷酸；b)末端脱氧核苷酸转移酶和DNA连接酶；c)控尾组分，其中该控尾组分是由5至20个核苷酸长度的多核苷酸同聚物和X区，以及与X区互补的连接子多核苷酸组成的部分双链核苷酸分子；其中多核苷酸同聚物与a)中的脱氧核苷酸互补；
(2)孵育所述的第一混合物，脱氧多核苷酸单链底物的3’端与溶液中的脱氧核苷酸发生加尾反应，添加了多核苷酸同聚尾的底物3’端与控尾组分的连接子连接，得到加尾后的底物；
(3)在步骤(2)的反应体系中，添加DNA聚合酶、包含dGTP、dCTP、dATP和dTTP的脱氧核苷酸和线性扩增引物，以形成第二混合物；
(4)孵育所述第二混合物，以步骤(2)得到的加尾后的底物为模板进行第一次线性延伸反应，合成底物的互补链，再解链，线性扩增引物与底物互补后，再次进行后续的线性延伸反应，其中线性延伸反应的次数不低于3次；
(5)使步骤(4)的产物解链；
(6)在步骤(5)的溶液中添加5’测序接头和DNA连接酶形成第三混合物；
(7)孵育所述的第三混合物，5’测序接头与底物互补链结合，制备得到DNA文库。


如权利要求1所述的方法，其中a)中的脱氧多核苷酸是dATP。


前述任一项权利要求所述的方法，其中步骤(1)中的控尾组分包含5至13个核苷酸长度的多核苷酸同聚物。


前述任一项权利要求所述的方法，其中步骤(1)中的控尾组分包含7至10个核苷酸长度的多核苷酸同聚物。


前述任一项权利要求所述的方法，其中步骤(2)在温度20℃-50℃下进行，优选25℃-45℃，更优选25℃-37℃。


前述任一项权利要求所述的方法，其中步骤(3)的线性扩增引物与加尾后的底物的3’末端互补。


权利要求6所述的方法，其中步骤(3)的线性扩增引物与控尾组分的连接子互补。


前述任一项权利要求所述的方法，其中在步骤(4)的第一次线性延伸反应中，所用的引物是控尾分子。


前述权利要求1-7任一项所述的方法，其中在步骤(4)的第一次线性延伸反应中，所用的引物是步骤(3)中添加的线性扩增引物。


权利要求9所述的方法，其中在步骤(4)的第一次线性延伸反应中，控尾组分中与底物互补的序列被降解或被步骤(3)中添加的线性扩增引物所竞争。


前述任一项权利要求所述的方法，其中步骤(4)的线性延伸反应的次数不低于4次，优选为4-50次，进一步优选4-20次，更优选为4-12次。


前述任一项权利要求所述的方法，其中步骤(6)和(7)的5’测序接头的一条链的3’末端悬了0-50个随机碱基的单链多核苷酸。

【专利技术属性】
技术研发人员：张翼，陈琼，
申请(专利权)人：北京优乐复生科技有限责任公司，
类型：发明
国别省市：北京;11