【技术实现步骤摘要】
一种用MALDI-TOF-MS测定ADAMTS-13酶活性的底物、方法及试剂盒
本专利技术属于医学分子生物学，蛋白多肽检测
，尤其涉及一种能够利用MALDI-TOF-MS来检测金属蛋白酶ADAMTS-13酶活性的底物、方法及试剂盒。
技术介绍
MALDI-TOF-MS(基质辅助激光解吸离子化飞行时间质谱)主要有三部分组成：第一部分是金属载片，可以定向选择为金属螯合芯片，第二部分是飞行时间质谱仪，也可以称做质谱阅读器，第三部分是系统专用分析软件。本检测方法将采用金属螯合芯片载片，金属螯合芯片表面可以螯合正二价金属离子Ni，可以特异性的捕获带有组氨酸基团的蛋白质多肽。质谱阅读器，就是基质辅助激光解析电离飞行时间质谱仪。其通过激光脉冲辐射将样品转化为运动的气态离子并按质荷(M/Z)大小进行分离，根据不同质荷比在电场中飞行时间长短不一，从而绘制出一张质谱图。系统专用分析软件用来处理实验所得的数据。通过对获取数据进行计算分析，从而定量导出计算ADAMTS-13酶活性的准确数值。MALDI-...
【技术保护点】
1.一种体外定量测定ADAMTS-13酶活性的底物获得，其特征在于：包括vWF82 DNA片段的获得，以人脐静脉内皮细胞为质粒模板分别进行PCR扩增vWF82的DNA片段。设计引物序列如下：/n正义链：/n5_-cgggatccGACCACAGCTTCTTGGTCAGCC-3_，/n反义链：/n5_-cggaattc
【技术特征摘要】
1.一种体外定量测定ADAMTS-13酶活性的底物获得，其特征在于：包括vWF82DNA片段的获得，以人脐静脉内皮细胞为质粒模板分别进行PCR扩增vWF82的DNA片段。设计引物序列如下：
正义链：
5_-cgggatccGACCACAGCTTCTTGGTCAGCC-3_，
反义链：
5_-cggaattcTCAGTGATGGTGATGGTGATGTCGGGGGAGCGTCTCAAAGTCC-3_.
两条引物分别引入BamHI和Hindm的酶切位点(小写英文字母部分)，并于C末端各插入一个6XHisTag(下划线部分)。
2.一种采用根据权利要求1所述底物的体外测定量测定ADAMTS-13酶活性的方法，其特征在于：包括以下步骤：
(1)ADAMTS-13酶切底物GST-vWF82-6XHis重组蛋白的表达纯化：
1.1.vWF的82个氨基酸片段D1587～R1668以及C末端6个组氨酸(6XHis)被插入到N端带有GST蛋白的细菌表达载体pGEX6p-1上；
1.2.挑选阳性克隆，并转染BL21表达细菌；
1.3.大量培养细菌，收集菌体，利用超声进行细菌裂解，高速离心以后收集上清，并加入等体积PBS缓冲液稀释；
1.4.通过GST亲和柱纯化蛋白，利用还原性谷胱甘肽进行洗脱，从而得到纯化的重组蛋白GST-vWF82-6XHis作为本技术需要用到的酶切底物；
1.5.取一定量的GST-vWF82-6XHis和切割蛋白酶PrescissionProtease孵育，得到本技术在检测阶段需要用到的内参照；
(2)酶切反应：
需要用到以下试剂和仪器：
一组血清标准物，混合正常人血浆被系列稀释成100％，50％，20％，10％，5％以及2.5％，用来稀释的溶液配方如下：150mMNaCl，0.1％BSA，1XPBS；
高低对照，将PNP稀释成50％以及5％分别作为高低对照；
反应缓冲液：50mMTris-ClpH8.0，1mMBaCl2，50mMNaCl；
芯片激活缓冲液：50mMNiSO4；
芯片结合缓冲液：1XPBS；
芯片洗脱缓冲液：1XPBS，300mMNaCl，0.1％Tween20；
能量吸收物质EAM：SPA(5mg溶于200ul50％ACN，200ul0.5％TFA)；
金属螯合芯片重生缓冲液：50mMEDTA，5...
【专利技术属性】
技术研发人员：刘学博，马龙华，谭爱国，王文静，张佳华，周游，江游，于海波，李宁，
申请(专利权)人：刘学博，马龙华，谭爱国，王文静，张佳华，周游，江游，于海波，李宁，
类型：发明
国别省市：北京;11
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