本发明专利技术涉及基于多重PCR及高通量测序技术检测耳聋基因致病变异的特异性引物、试剂盒及应用，可以高效率、低成本、全面化的诊断大部分遗传性耳聋；还可以用于新生儿筛查，早发现早治疗，减少“因聋致哑”，其解决的技术方案是，该多重PCR特异性引物包括34对特异性引物，分成两个Pool，Pool‑1包含18对引物，核酸序列如SEQ ID NO：1‑SEQ ID NO：36所示；Pool‑2包含16对引物，核酸序列如SEQ ID NO：37‑68所示，本发明专利技术可有效提高检测效率、准确率，同时降低成本、简化操作步骤，是检测耳聋基因致病变异的特异性引物上的创新。
【技术实现步骤摘要】
一种基于多重PCR及高通量测序技术检测耳聋基因致病变异的特异性引物、试剂盒及应用
本专利技术涉及基因检测领域，特别是一种基于多重PCR及高通量测序技术检测耳聋基因致病变异的特异性引物、试剂盒及应用。
技术介绍
耳聋是最常见的残疾之一，会严重影响人类的认知和交流，全球听力障碍者多达3.6亿人(WHO，2017)。大约500名新生儿中就有1名受到听力损失的影响。在中国，大约有80万名不到7岁的听力障碍儿童，并且这一数字每年以30,000例的速度增加。与遗传因素相关的非综合症或综合症性耳聋约占60％。非综合性耳聋通常是指没有其他临床症状的耳聋，占遗传性耳聋的70％。感音神经性耳聋中约80％是常染色体隐性遗传(AR)，除此之外，接近20％耳聋为常染色体显性遗传(AD)和少于1％的X染色体连锁或线粒体。除佩戴助听器、人工电子耳蜗植入，目前对于遗传性耳聋尚无特效治疗方法。因此，早期诊断和预防对遗传性耳聋的临床干预至关重要。根据解放军总医院聋病分子诊断中心关于中国聋病分子流行病学的调查研究，GJB2和SLC26A4基因突变是导致中国人耳聋的第一位和第二位致病原因，GJB3是最先由我国学者克隆出的耳聋致病基因，而12SrRNA突变是导致中国人药物性致聋的主要原因，USH2A基因也是在中国耳聋人群中检出率较高的基因。国外研究表明约有50％的常染色体隐性遗传性耳聋是由于GJB2基因突变导致的，在中国耳聋人群中GJB2检出率达21.6％，明确由该基因致聋的比例达18.2％。由于GJB2基因短小，而且突变热点多，成为耳聋基因检测的最基本项目。GJB3基因编码间隙连接蛋白，位于1p34.3，最先是由我国学者克隆出的耳聋致病基因，可以导致常染色体显性和常染色体隐性遗传的耳聋。SLC26A4是中国人群中第二位致聋基因，该基因突变后可以导致Pendred综合征和常染色体隐性耳聋DFNB4，患者均有前庭导水管扩大，前庭导水管扩大的病人约有96％是由于该基因突变导致的。该基因在中国耳聋患者中检出率为20.35％，SLC26A4：c.919-2A>G是该基因的热点突变，15.23％耳聋患者携带此突变，前庭导水管扩大病人中有74.8％携带此突变。12SrRNA突变是导致中国人药物性致聋的主要原因，携带此基因突变的人在使用氨基糖苷类抗生素抗生素后会导致耳聋，分为用药过量致聋和个体对该类抗生素过敏而致聋。该基因主要存在A1555G和C1494T两种突变类型，检出率分别为1.72％和0.15％。Usher综合征即感音神经性耳聋-视网膜色素变性综合征，遗传方式为常染色体隐性，除感音神经性耳聋外还伴有视网膜色素变性和不同程度的前庭功能障碍。UAH2A基因是导致Usher2型综合征最常见的致病基因，在Usher2型综合征患者中检出率为74-90％，因此UAH2A基因筛查尤为重要。一代测序是遗传性耳聋基因检测的传统方法，是基因检测的金标准；然而，该技术费时费力，通量低价格高，从而限制了其临床应用。结合耳聋基因的微阵列芯片诊断技术能够快速取得结果,但是该方法包含的基因和位点数量有限，不能检测出患者携带的罕见变异，致使在许多患者无法得到诊断。变性高效液相色谱法具有自动化高，检测成本低的特点，并且能够同时检测多个变异位点，但是其技术要求高，且需要特殊仪器，限制了其在临床应用，现多用于实验室检测。飞行时间质谱法具有较高的通量，每台仪器单日可检测3000例样本，可检测位点多、并且高效准确，但对人员技术和检测样品纯度要求高，并且仪器昂贵，不适合在一般的医疗机构开展，限制了其广泛应用。事实证明，下一代测序(NGS)的最新应用在鉴定耳聋患者的致病突变方面具有强大的功能。多重PCR可同时扩增同一反应管中的多个区域，从而显著节省时间和试剂，并提供更准确的诊断信息。
技术实现思路
针对上述情况，为解决现有技术之缺陷，本专利技术之目的就是提供一种基于多重PCR及高通量测序技术检测耳聋基因致病变异的特异性引物、试剂盒及应用，可以高效率、低成本、全面化的诊断大部分遗传性耳聋；还可以用于新生儿筛查，早发现早治疗，减少“因聋致哑”。本专利技术解决的技术方案是，该多重PCR特异性引物包括34对特异性引物，分成两个Pool，Pool-1包含18对引物，核酸序列如SEQIDNO：1-SEQIDNO：36所示；Pool-2包含16对引物，核酸序列如SEQIDNO：37-68所示。所述的特异性引物均为经过修饰的引物(如硫代修饰)，引物与引物之间不形成二聚体，引物自身不形成发夹结构，引物与模板之间不发生错配，且引物设计区域不存在突变位点。同时，在引物设计时，每对引物之间的退火温度差异小于2摄氏度，扩增产物长度在200-300bp之间。一种基于多重PCR及高通量测序技术检测耳聋基因致病变异的试剂盒：至少包括34对特异性引物中的一对，除特异性引物之外，所述试剂盒还包括通用引物、Index、酶混合物、质控品、无核酸酶水；其中通用引物用于对特异引物扩增目标区域的扩增产物进行再次扩增，Index用于对不同待测样品的目标区域扩增产物进行标记，为8个碱基的核苷酸序列。酶混合引物包括：高保真DNA聚合酶、PCRBuffer、dNTP混合物等，阴性质控品为正常人基因组DNA，阳性质控品为3个分别携带GJB2:c.235delC、SLC26A4:c.919-2A>G和MT:1555A>G变异的人类基因组DNA，空白质控品为无核酸酶水。一种基于多重PCR及高通量测序技术检测耳聋基因致病变异的检测方法，包括以下步骤：1)使用磁珠法对待测样本进行核酸提取，然后使用Nanodrop进行浓度及纯度的测定，合格后按操作标准进行定量稀释至1-10ng/μl，终体积大于11μl，备用；建库时应尽量使用最新制备或者质量优良的模板，如不能及时建库，模板短期可2-8℃保存，长期可在-20℃保存，避免反复冻融。2)第一轮PCR:用所述特异性引物及试剂盒中的其他相关试剂配制如下反应体系，按照如下PCR反应程序对所提取的DNA的目标区域进行PCR扩增，备用；3)第二轮PCR：将第一轮PCR中Pool-1和Pool-2混合，并配制如下反应体系，进行末端修饰，通用接头与Index连接。4)纯化使用磁珠法对第二轮PCR中扩增产物进行纯化，将纯化后的扩增子文库使用4.0FluorometerQubit(dsDNAHSAssayKit)进行浓度测定，记录文库浓度。Agilent4200TapeStation(Agilent4200TapeStationD1000ScreenTape)或Agilent2100Bioanalyzersystem(AgilentDNA1000Kit)进行片段长度测定，若片段长度主要分布在300-500bp，主峰在380±10bp，质检合格，定量混样，上机测序；若长度分布超出300-500bp，或者主峰不在380±10bp之间，重复建库并质检若再次不合格，检测中止，空白质控组(BC)应本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种基于多重PCR及高通量测序技术检测耳聋基因致病变异的特异性引物，其特征在于，该多重PCR特异性引物包括34对特异性引物，分成两个Pool，Pool-1包含18对引物，核酸序列如SEQ ID NO：1-SEQ ID NO：36所示；Pool-2包含16对引物，核酸序列如SEQ ID NO：37-68所示。/n
【技术特征摘要】
1.一种基于多重PCR及高通量测序技术检测耳聋基因致病变异的特异性引物，其特征在于，该多重PCR特异性引物包括34对特异性引物，分成两个Pool，Pool-1包含18对引物，核酸序列如SEQIDNO：1-SEQIDNO：36所示；Pool-2包含16对引物，核酸序列如SEQIDNO：37-68所示。
2.根据权利要求1所述的基于多重PCR及高通量测序技术检测耳聋基因致病变异的特异性引物，其特征在于，所述的特异性引物均为经过修饰的引物，引物与引物之间不形成二聚体，引物自身不形成发夹结构，引物与模板之间不发生错配，且引物设计区域不存在突变位点，同时，在引物设计时，每对引物之间的退火温度差异小于2摄氏度，扩增产物长度在200-300bp之间。
3.一种基于多重PCR及高通量测序技术检测耳聋基因致病变异的试剂盒，其特征在于，所述的试剂盒至少包括上述权利要求1-2任一项所述34对特异性引物中的一对。
4.权利要求4所述的基于多重PCR及高通量测序技术检测耳聋基因致病变异的试剂盒在遗传性耳聋致病基因检测中的应用。
5.根据权利要求3所述的基于多重PCR及高通量测序技术检测耳聋基因致病变异的试剂盒，其特征在于，所述的试剂盒还包括通用引物、Index、酶混合物、质控品、无核酸酶水；其中通用引物用于对特异引物扩增目标区域的扩增产物进行再次扩增，Index用于对不同待测样品的目标区域扩增产物进行标记，为8个碱基的核苷酸序列，酶混合引物包括：高保真DNA聚合酶、PCRBuffer、dNTP混合物，阴性质控品为正常人基因组DNA，阳性质控品为3个...
【专利技术属性】
技术研发人员：汤文学，许红恩，杨增光，刘欢飞，李瑞君，张娟丽，于婷，郭建成，郭永军，田永安，
申请(专利权)人：郑州桑林生物科技有限公司，郑州大学，
类型：发明
国别省市：河南;41
还没有人留言评论。发表了对其他浏览者有用的留言会获得科技券。