一种恶性高热多重PCR-LDR分子诊断试剂盒及其应用制造技术

本发明专利技术公开了一种恶性高热多重PCR‑LDR分子诊断试剂盒，包括18对特异性引物(核苷酸序列如SEQ ID NO.1‑36所示)，1组通用荧光探针和49组检测探针(核苷酸序列如SEQ ID NO.37‑179所示)。还包括PCR扩增试剂、LDR连接反应试剂、基因分型试剂和质控品，所述质控品包括阴性质控品、野生型质控品和阳性质控品。本发明专利技术的试剂盒同时可检出49个基因多态性位点，可用于基因分型、DNA多态性检测、恶性高热(MH)分子诊断等。本发明专利技术的试剂盒由于测序结果的直接性，解决了结果的假阳性和假阴性。本发明专利技术的试剂盒具有通量高、灵敏度高、操作简单流程短、结果分析更简单化、节约成本低等优点。

【技术实现步骤摘要】
一种恶性高热多重PCR-LDR分子诊断试剂盒及其应用
本专利技术涉及一种恶性高热多重PCR-LDR分子诊断试剂盒及其应用，属于DNA分子检测

技术介绍
恶性高热(Malignanthyperthermia,MH)是一类具有家族遗传性的亚临床性骨骼肌的遗传药理学疾病，常由含卤素的挥发性吸入麻醉药(氟烷、安氟醚、异氟醚等)及去极化肌松药(琥珀胆碱)所诱发，表现为与骨骼肌代谢亢进有关的高热、肌肉强直、心动过速、混合性酸中毒、肌酶升高、肌红蛋白尿等一系列综合征。全麻用琥珀胆碱发生率约为1/22万。国内也有氯胺酮、利多卡因、氟哌啶醇、氯氮平等诱发可疑恶性高热的报道。在国外文献中MH被称为一种可怕的不稳定的代谢性疾病，该病发展凶险，难以预见，由于机体长时间处于致病性代谢亢进综合征状态导致多脏器官功能衰退而死亡。日本报道自1961至2004年共有383例暴发型重度恶性高热。其中1985到2004年间有187例，平均每年9例。这20年内使用丹曲林的病例占90％，死亡率15％。相比之下，1961到1984年间的196病例中，使用丹曲林的只有18本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种恶性高热多重PCR-LDR分子诊断试剂盒，包括18对特异性引物，1组通用荧光探针和49组检测探针；其中，18对特异性引物的核苷酸序列如下：/n用于CACNA1S基因C.520C/T基因位点检测的上下游引物分别为：/nSEQ NO.1C.520F:5'CCCTGGACCCCCTCTCTC 3'；/nSEQ NO.2C.520R:5'TGGGAAGCCCCTGAGATG 3'；/n用于CACNA1S基因C.3257G/A位点检测的上下游引物为：/nSEQ NO.3C.3257F:5'GCTGTGATAACTCAAGGGGAAC 3'；/nSEQ NO.4C.3257R:5'GGGCAAAC...

【技术特征摘要】
1.一种恶性高热多重PCR-LDR分子诊断试剂盒，包括18对特异性引物，1组通用荧光探针和49组检测探针；其中，18对特异性引物的核苷酸序列如下：
用于CACNA1S基因C.520C/T基因位点检测的上下游引物分别为：
SEQNO.1C.520F:5'CCCTGGACCCCCTCTCTC3'；
SEQNO.2C.520R:5'TGGGAAGCCCCTGAGATG3'；
用于CACNA1S基因C.3257G/A位点检测的上下游引物为：
SEQNO.3C.3257F:5'GCTGTGATAACTCAAGGGGAAC3'；
SEQNO.4C.3257R:5'GGGCAAACATCAGGTATTCAA3'；
用于RYR1易感基因位点C.103T>C,C.130C>T检测的上下游引物为：
SEQNO.5C.103F:5'ATAAATGGGATGATGCTGGC3'；
SEQNO.6C.103R:5'GAACCCTCTTCTTTGGACCC3'；
用于RYR1易感基因位点C.487C>T,C.488G>T检测的上下游引物为：
SEQNO.7:C.487-488-F:5'AGAGTTGGTGGCAGTGATAGG3'；
SEQNO.8:C.487-488-R:5'AGTCGGGCAATGGGAGGT3'；
用于RYR1易感基因位点C.742G>A/C.742G>C检测的上下游引物为：
SEQNO.9:C.742F:5'AGTGTCTGACCATTTCCCCTG3'；
SEQNO.10:C.742R：5'GCTGCTCTGATTTTCCCTCG3'；
用于RYR1易感基因位点C.982C>T,C.1021G>C/C.1021G>A检测的上下游引物为：
SEQNO.11:C.982F:5'CTTCTGCTTCCGCATCTCC3'；
SEQNO.12:C.982R:5'CTCCTGGACTCAAGCGATTCT3'；
用于RYR1易感基因C.1565A>C,C.1597C>T,C.1598G>A及C.1654C>T位点检测的上下游引物为：
SEQNO.13:C.1565-1654-F：5'CCGCCTAAATGTCTACACCAC3'；
SEQNO.14:C.1565-1654-R:5'AGGAGGGAGATGATGGACTTG3'；
用于RYR1易感基因C.1840C>T，C.1841G>T位点检测的上下游引物为：
SEQNO.15:C.1840-41-F：5'ATCCTGCCCTGGTGCCTAC3'；
SEQNO.16:C.1840-41-R：5'CATCTGGGTGTGGAGTCTCTAAG3'；
用于RYR1易感基因C.7007G>A位点检测的上下游引物为：
SEQNO.17:C.7007-F：5'CAGCCCAGTAGGTCTCAAGC3'；
SEQNO.18:C.7007-R：5'CAGGGTGCGAGCAGTCAT3'；
用于RYR1易感基因位点C.7042-7045DEL，C.7048G>A，C.7063C>T，C.7124G>C，C.7282G>A，C.7300G>A，C.7304G>A检测的上下游引物为：
SEQNO.19:C.7042-C.7304F:5'GGGGAGGTCTCTGATGGTG3'；
SEQNO.20:C.7042-C.7304R:5'ATGAGGCGTTCAAAGCGG3'；
用于RYR1易感基因C.7354C>T，C.7360C>T，C.7361G>A，C.7372C>T，C.7373G>A，C.7522C>T/C.7522C>A，C.7523G>A位点检测的上下游引物为：
SEQNO.21:C.7522-C.7523F:5'CACAGGCAGAGGAACGAGG3'；
SEQNO.22:C.7522-C.7523R:5'CTGGGCAGGGTTGCTCAC3'；
用于RYR1易感基因C.9310G>A位点检测的上下游引物为：
SEQNO.23:C.9310F:5'CCCAACCCCTGGTCTCCT3'；
SEQNO.24:C.9310R:5'GCTTACAGCAAGAAATCCACACA3'；
用于RYR1易感基因C.11969G>T位点检测的上下游引物为：
SEQNO.25:C.11969F:5'AGAGGAACTTCTCCAAAGCCAT3'；
SEQNO.26:C.11969R:5'GCACTCGGGTGACAAACTGA3'；
用于RYR1易感基因C.14387A>G,C.14477C>T,C.14497C>T,C.14512C>G,C.14545G>A及C.14582G>A位点检测的上下游引物为：
SEQNO.27:C.14387-C.14582F:5'CCTTCCCCCTGACCCCT3'；
SEQNO.28:C.14387-C.14582R:5'CTCAAGTAATCGTCCCGCC3'；
用于RYR1易感基因C.14693T>C位点检测的上下游引物为：
SEQNO.29:C.14693F:5'TTGGTCCCTGTCTGATGCC3'；
SEQNO.30:C.14693R:5'GAGAGGTAGAGATGGGGTATGAA3'；
用于RYR1易感基因C.1201C>T，C.1209C>G位点检测的上下游引物为：
SEQNO.31:C.1201-09-F5'GGACAGAAAAATGAGGAGGAAT3'；
SEQNO.32:C.1201-09-R5'TAGACAAGGGTGTGGGCAAC3'；
用于RYR1易感基因C.6487C>T，C.6488G>A，C.6502G>A位点检测的上下游引物为：
SEQNO.33:C.6487-6502-F5'GCCCAAGAGGACTTCGTG3'；
SEQNO.34:C.6487-6502-R5'ATGTTATTGTATCCTGAGGGTATTC3'；
用于RYR1易感基因C.6617C>G/C.6617C>T位点检测的上下游引物为：
SEQNO.35:C.6617-F5'GAGGGTCAAGAATGCCAACG3'；
SEQNO.36:C.6617-R5'GCCACTGTTCTCCAGCAGGTAG3'；
所述通用探针的核苷酸序列情况如下(下述所有序列的方向均为5’端-3’端)：
SEQNO.37：LDR通用模板：GCCAGTTAAGCTAAGAGTACAGGTTTGCG；
SEQNO.38：通用荧光探针：P-CTTAGCTTAACTGGC–FAM；其5’端进行磷酸化修饰，3’端进行荧光染料标记；
所述49组检测探针的核苷酸序列如下：
SEQNO.39：C.520M:P-GAGGGGTCTGAGCACTCGGATTTttTTCGCAAACCTGTACTC；
SEQNO.40：C.520C：TAGGCACCCCCGACACCAGCCG；
SEQNO.41：C.520T：ttTAGGCACCCCCGACACCAGCCA；
SEQNO.42：C.3257M:P-GCTGTGACACATACAACAGGACTTTttttTTCGCAAACCTGTACTC；
SEQNO.43：C.3257G:CAGGGCATACTGTACACATTGGC；
SEQNO.44：C.3257A:TTCAGGGCATACTGTACACATTGGT；
SEQNO.45：C.103M:P-GAGCTTGAGCTGCTCCTTGAGCATTTTTTTTTTTCGCAAACCTGTACTC；
SEQNO.46：C.103T:TGCCGAAGCCCTCGGCGGCCAGGCA；
SEQNO.47：C.103C:TTTGCCGAAGCCCTCGGCGGCCAGGCG；
SEQNO.48：C.130M：P-GTTGCCGAAGCCCTCGGCGGCCAGGCTTTTTTTTTTCGCAAACCTGTACTC；
SEQNO.49：C.130C:TGCTAGTGGGCTCCAGGAAGCACAGGCG；
SEQNO.50：C.130T:TTTGCTAGTGGGCTCCAGGAAGCACAGGCA；
SEQNO.51：C.487M:
P-GACCTTTTCTCCTTCAGACCTCTGCTTGGAGTTTTTTTTTTTTTCGCAAACCTGTACTC；
SEQNO.52：C.487C:CAAGGATGATGTCATCCCCAACGCG；
SEQNO.53：C.487T:TTCAAGGATGATGTCATCCCCAACGCA；
SEQNO.54：C.488M:
P-GGACCTTTTCTCCTTCAGACCTCTGCTTGGAGTTTTTTtTTTTTTTTTTCGCAAACCTGTACTC；
SEQNO.55：C.488G:ACAAGGATGATGTCATCCCCAACGC；
SEQNO.56：C.488T:TTACAAGGATGATGTCATCCCCAACGA；
SEQNO.57：C.742M:
p-CTCATAGTAGACAAGTCTGGGGACACAGAATTTTTTTTTTTTTTTTTTtTTCGCAAACCTGTACTC；
SEQNO.58：C.742G:AGCGGGCATGAGTGCACACAGCTCCCCC；
SEQNO.59：C.742A:TtAGCGGGCATGAGTGCACACAGCTCCCCT；
SEQNO.60：
C.982M:P-CTTGGGGGCCACATCCAGCTTCTCCTACATTTTTTTTTTTTTTTTTTttttttttttttTTCGCAAACCTGTACTC；
SEQNO.61：C.982C:GGGGGGCCCATGCCCTCCACATCCCG；
SEQNO.62：C.982T:TTGGGGGGCCCATGCCCTCCACATCCCA；
SEQNO.63：C.1021M:
P-GTACTTGATCTCAGGGGGGCCCATGCCCTCCACATCTTTTTTTTtttttTTTTttttttTTCGCAAACCTGTACTC；
SEQNO.64：C.1021G:CACATGCTGCACGAAGCACAGTGACTCCCC；
SEQNO.65：C.1021C:TTCACATGCTGCACGAAGCACAGTGACTCCCG；
SEQNO.66：C.1021A:TtTTCACATGCTGCACGAAGCACAGTGACTCCCT；
SEQNO.67：C.1565M:
P-AGCCGAGTCCTGGAAAGAGATTGTGAATCTTCTCTTTTTTTTTttTTTTTTTTTtttttttttTTCGCAAACCTGTACTC；
SEQNO.68：C.1565A:ttttCAGGACTGGGACCCCTACCTAGGAGTTCA；
SEQNO.69：C.1565C:ttttTTCAGGACTGGGACCCCTACCTAGGAGTTCG；
SEQNO.70：C.1597M:
P-ATTGCCACGGATTAGAGAAGCTGAGGGGGGAAGAGGTGTTTTTTttttttttttttttttttTTCGCAAACCTGTACTC；
SEQNO.71：C.1597C:ttttTCCAAGTTTGTGGAGAAGAGGGCACAGTTGCTACG；
SEQNO.72：C.1597T:ttttttTCCAAGTTTGTGGAGAAGAGGGCACAGTTGCTACA；
SEQNO.73：C.1598M:
P-GATTGCCACGGATTAGAGAAGCTGAGGGGGGAAGAGGTGTTTTTTtttttttTTTTttttttttttTTCGCAAACCTGTACTC；
SEQNO.74：C.1598G:ttttTCCAAGTTTGTGGAGAAGAGGGCACAGTTGCTACGC；
SEQNO.75：C.1598A:ttttttTCCAAGTTTGTGGAGAAGAGGGCACAGTTGCTACGT；
SEQNO.76：C.1598M1:
P-GATTGCCACGGATTAGAGAAGCTGTTtttttttttttttttttTTCGCAAACCTGTACTC；
SEQNO.77：C.1598G1:
ttttttttttttttttttttttttttttttttttGTTTGTGGAGAAGAGGGCACAGTTGCTAC；
SEQNO.78：C.1598A1:
ttttttttttttttttttttttttttttttttttttGTTTGTGGAGAAGAGGGCACAGTTGCTAT；
SEQNO.79：C.1654M:
P-ATCCAGCTTGCTGACCAGCCAGTCCAAGTTTGTGGAGAAGTTTTTTtttttttTTTTTTTTTTttttttttttTTCGCAAACCTGTACTC；
SEQNO.80：C.1654C:ttttCCCGGGTTCTCCTACCAGACGAGGCCTCCAGCCG；
SEQNO.81：C.1654T:ttttttCCCGGGTTCTCCTACCAGACGAGGCCTCCAGCCA；
SEQNO.82：C.1840M:
P-TACAGCCACACCATTACACACACACAGGGAGCATAGCACGTCCAGGACTTTTttttttTTTTTTTTTTttttttttttTTCGCAAACCTGTACTC；
SEQNO.83：C.1840C:ttttGCAAGTTCTCAGTAATAAGATCTTGGTTGGAGCG；
SEQNO.84：C.1840T:ttttttGCAAGTTCTCAGTAATAAGATCTTGGTTGGAGCA；
SEQNO.85：C.1841M:
P-GTACAGCCACACCATTACACACACACAGGGAGCATAGCACGTCCAGGACTTTTtttTTTTTtttTTTTTTTTTTttttttttttTTCGCAAACCTGTACTC；
SEQNO.86：C.1841G:ttttGCAAGTTCTCAGTAATAAGATCTTGGTTGGAGC；
SEQNO.87：C.1841T:ttttTTGCAAGTTCTCAGTAATAAGATCTTGGTTGGAGA；
SEQNO.88：C.7007M:P-GCAGGAAGTCCAGGTAGCGCTCTCGCAAACCTGTACTC；
SEQNO.89：C.7007G:CACCGTTGACGAAGACAGCAAAGC；
SEQNO.90：C.7007A:ttCACCGTTGACGAAGACAGCAAAGT；
SEQNO.91：C.7042-7045M:P-CTCCACGCTCTCGCCTGGCCATTTTTTTCGCAAACCTGTACTC；
SEQNO.92：C.7042-7045DEL:ttGCCGCACCACCACATTGGCGTT；
SEQNO.93：C.7042-7045:tGCCGCACCACCACATTGGCGTTCTC；
SEQNO.94：C.7048M:P-GTTCTCCTCCACGCTCTCGCCTGGCCTTTTTTTCGCAAACCTGTACTC；
SEQNO.95：C.7048G:tAGCAGCCGCACCACCACATTGGC；
SEQNO.96：C.7048A:ATGAGCAGCCGCACCACCACATTGGT；
SEQNO.97：C.7063M:P-CACCACCACATTGGCGTTCTCCTCCTTTTTTTCGCAAACCTGTACTC；
SEQNO.98：C.7063C:ttAGCACTCAGGCTTCCGGATGAGCAGCCG；
SEQNO.99：C.7063T:ttttAGCACTCAGGCTTCCGGATGAGCAGCCA；
SEQNO.100：C.7124M1:P-CTGAGCCACCCTCACCCCGCAGGTTTTTCGCAAACCTGTACTC；
SEQNO.101：C.7124G1:tttttttttttttttTtTTTTCGATGGCAGCCAGCAGCC；
SEQNO.102：C.7124C1:ttttATGGCCTCTTCGATGGCAGCCAGCAGCG
SEQNO.103：C.7282M:
P-GGCATAGAAGGACATGATGGCGTGTCCCAGGTGCACtttTTTTTTTCGCAAACCTGTACTC；
SEQNO.104：C.7282G:ttGCGTCCGAGCAGGTCGATCAAGGC；
SEQNO.105：C.7282A:ttttGCGTCCGAGCAGGTCGATCAAGGT；
SEQNO.106：
C.7300...

【专利技术属性】
技术研发人员：步迅，刘艳艳，杨雪，段文元，马素军，
申请(专利权)人：诚谨医学检验所山东有限公司，
类型：发明
国别省市：山东;37