食品中铜锌-超氧化物歧化酶酶活的检测方法技术

本发明专利技术公开了一种食品中铜锌‑超氧化物歧化酶酶活的检测方法，其包括以下步骤：制备待检测样品提取液，并分为等量的第一份样品提取液和第二份样品提取液；以邻苯三酚自氧化法测定第一份样品提取液的酶活为U1；在第二份样品提取液中加入酶灭活剂，酶灭活剂为酶抑制剂和氨基酸的混合物，用邻苯三酚自氧化法测定第二份样品提取液的伪酶活U2；计算待检测样品提取液酶活实际值U＝U1‑U2。本发明专利技术综合采用酶抑制剂结合氨基酸的处理手段，能有效检测出样品中真实的SOD酶活性，而且操作简单、成本低、易于在基层检测机构推广应用。

【技术实现步骤摘要】
食品中铜锌-超氧化物歧化酶酶活的检测方法
本专利技术涉及一种食品中铜锌-超氧化物歧化酶酶活的检测方法。
技术介绍
超氧化物歧化酶(SOD)是一种催化超氧阴离子自由基(O2-)通过歧化反应转化为氧气和过氧化氢的酶类，它的作用是降低超氧化物对生命体的毒害作用，使处于氧环境下的所有生命细胞具有一种抗氧化防御机制，它的活性的高低代表了生物应对胁迫的能力。SOD分布极为广泛，迄今已从细菌、真菌、藻类、植物、原生动物、昆虫、鱼类和哺乳动物等各种生物体内分离到。当生物受到外界生理或非生理因素胁迫而产生过量的活性氧时，超氧化物歧化酶就可以清除这些氧自由基，从而防止氧自由基破坏细胞的组成、结构和功能，保护细胞免受氧化损伤。SOD是生物体内最重要的且最佳的自由基清除剂，已被充分证明了其在防治与超氧自由基有关疾病方面的有效作用，例如延缓人体衰老、预防疾病、改善人体免疫力，并已在食品及化妆品中有应用。Cu/Zn-SOD是分布最为广泛而且研究最深入的一种SOD。大多数原始的无脊椎动物细胞中都存在Cu/Zn-SOD，脊椎动物则一般含有Cu/Zn-SOD和Mn-SOD，人、鼠、猪、牛等红细胞和肝细胞中含Cu/Zn-SOD，其主要存在于细胞质，同时也存在于线粒体内外膜之间，真菌里一般含Mn-SOD和Cu/Zn-SOD。Cu/Zn-SOD的活性中心包括一个Cu离子和一个Zn离子。研究表明，Cu的存在是Cu/Zn-SOD活性所必需的，它直接与超氧阴离子自由基作用。Zn周围环境拥挤，不直接与超氧阴离子自由基作用，它起到稳定活性中心周围环境的作用。二价铜离子与其周围四个组氨酸上的氮原子以配位键结合，构型是一个畸变的近平面四方形。Zn的周围有三个组氨酸通过氮原子与之配位，其中一个组氨酸被Cu和Zn所共用，形成咪唑桥结构。另外，Zn还同一个天冬氨酸残基配位，使Zn形成畸面四面体配位构型。目前，超氧化物歧化酶活性的主要测定方法有直接法、邻苯三酚自氧化法、细胞色素C还原法、化学发光法、荧光动力学法、免疫学方法、简易凝胶过滤扩散法、极谱氧电极法、微量测活方法等。1.直接法是根据O2-或产生O2-的物质本身的性质测定O2-的歧化量，从而确定SOD的活性。经典的直接法包括：脉冲辐射分解法、电子顺磁共振波法(EPR)、核磁共振法。由于所需的仪器设备价格昂贵，一般较少应用。2.邻苯三酚自氧化法是基于经典的分光光度法，在碱性条件下，邻苯三酚自氧化成红桔酚，测定波长为325nm、420nm或650nm，同时产生O2-，SOD催化O2-发生歧化反应从而抑制邻苯三酚的自氧化，样品对邻苯三酚自氧化速率的抑制率，可反映样品中的SOD含量。该法具有特异性强，所需样本量少，操作快速简单，重复性好，灵敏度高，试剂简单等优点。3.细胞色素C还原法是黄嘌呤-黄嘌呤氧化酶体系中产生的O2-使一定量的氧化型细胞色素C还原为还原型细胞色素C，后者在550nm有最大吸收。在SOD存在时，由于一部分O2-被SOD催化而歧化，O2-还原细胞色素C的反应速度则相应减少，即其反应受到抑制。将抑制反应的百分数与SOD浓度作图可得到抑制曲线，由此计算样品中SOD活性，但该法灵敏度较低。4.化学发光法是黄嘌呤氧化酶在有氧条件下，催化底物黄嘌呤或次黄嘌呤发生氧化反应生成尿酸，同时产生O2-。后者可与化学发光剂鲁米诺反应，使其产生激发。SOD能清除O2-从而抑制鲁米诺的化学发光。该法灵敏度高，简便易行，特异性与准确性与细胞色素C还原法类似。5.免疫学方法特异性较好，包括放射免疫法、化学发光免疫分析法、ELISA法等，其缺陷是只能测定抗体相应的抗原，对于检测不同种类的SOD，则须制备相应的特异性抗体，手续繁琐。SOD催化的反应是超氧阴离子自由基转化为自由态的氧气和过氧化氢，超氧阴离子自由基的量较难检测，而对氧气和过氧化氢的测定也都是比较麻烦的，所以，目前对SOD活性的测定一般使用间接法，即利用物质自身产生超氧阴离子自由基或者通过刺激产生超氧阴离子自由基和中间产物，而SOD可以抑制这种中间产物的生成，根据使中间产物生成速率降低50％的酶量来定义SOD的活性。相对而言，邻苯三酚自氧化法只需一般的恒温水浴设备，条件容易控制，产物比较稳定，所用试剂和仪器比较普通，成本低，易于进行大批量测定，是较为常用的方法，因而被国家标准GB/T5009.171-2003《保健食品中超氧化物歧化酶(SOD)活性的测定》引用，并列为第一法。但邻苯三酚自氧化法也有一定的缺陷，例如相对于免疫学方法，检测的特异性不高，在测定基质复杂的SOD样品时会可能被干扰。如果检测的样品中含有抗坏血酸、部分黄酮类化合物、多酚羟基化合物等，由于它们也能歧化O2-，会影响到测定的准确性。有文献报道绿茶比乌龙茶和红茶提取物的抗O2-效果更好是因为其含有的茶多酚与抗坏血酸较多，而并不一定是因为其SOD酶活性高。研究发现，大部分水果和蔬菜中均含有SOD，包括刺梨、香蕉、猕猴桃、菠萝、山楂、大蒜等，利用这些富含SOD的原料开发天然保健食品成为食品工业发展的一种新趋势，现已有产品投放市场，并以其中含有的SOD作为卖点宣传。但在相关产品需要检测SOD活性时，由于果蔬产品基质复杂，普遍含有抗坏血酸、黄酮、多酚类化合物，直接采用GB/T5009.171-2003中的邻苯三酚自氧化法，就容易得出不准确的结果。如果使用免疫学测定方法，或者在检测前采用透析、HPLC纯化的手段，虽然可以避免类似的问题，但存在需制备相应的特异性抗体、或需配备HPLC或者透析仪等设备、造成检测耗时较长、价格较贵，不适用于普遍推广使用，因此需要建立一种简便可行的基于邻苯三酚自氧化法的检测技术。
技术实现思路
本专利技术要解决的技术问题是为了克服现有技术存在的上述缺陷，提供一种食品中铜锌-超氧化物歧化酶酶活的检测方法。本专利技术是通过下述技术方案来解决上述技术问题：一种食品中铜锌-超氧化物歧化酶酶活的检测方法，其包括以下步骤：步骤1、制备待检测样品提取液，将该待检测样品提取液分为等量的两份，该两份分别为第一份样品提取液和第二份样品提取液；步骤2、对第一份样品提取液以邻苯三酚自氧化法进行酶活测定，得到第一份样品提取液的铜锌-超氧化物歧化酶的酶活为U1；在第二份样品提取液中加入用于使酶完全失活的酶灭活剂，酶灭活剂为酶抑制剂和氨基酸的混合物，室温保存2.5小时以上后，用邻苯三酚自氧化法进行酶活测定，得到第二份样品提取液的伪酶活为U2；步骤3、计算待检测样品提取液中铜锌-超氧化物歧化酶的酶活实际值U，U的计算公式为U＝U1-U2。步骤2中，酶抑制剂为十二烷基三甲基氯化铵或盐酸胍，氨基酸为组氨酸、色氨酸或苯丙氨酸。步骤2中，酶抑制剂为十二烷基三甲基氯化铵，氨基酸为色氨酸，酶灭活剂为色氨酸和十二烷基三甲基氯化铵的混合物，在第二份样品提取液中加入色氨酸和十二烷基三甲基氯化铵的混合物，至色氨酸和十二烷基三甲基氯化铵混合物的浓度大于或者等于10mmol/L。步骤2中，酶抑制剂为十二烷基三甲基氯化铵，氨基酸为组氨酸，酶灭本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种食品中铜锌-超氧化物歧化酶酶活的检测方法，其特征在于，其包括以下步骤：/n步骤1、制备待检测样品提取液，将该待检测样品提取液分为等量的两份，该两份分别为第一份样品提取液和第二份样品提取液；/n步骤2、对第一份样品提取液以邻苯三酚自氧化法进行酶活测定，得到第一份样品提取液的铜锌-超氧化物歧化酶的酶活为U1；在第二份样品提取液中加入用于使酶完全失活的酶灭活剂，酶灭活剂为酶抑制剂和氨基酸的混合物，室温保存2.5小时以上后，用邻苯三酚自氧化法进行酶活测定，得到第二份样品提取液的伪酶活为U2；/n步骤3、计算待检测样品提取液中铜锌-超氧化物歧化酶的酶活实际值U，U的计算公式为U＝U1-U2。/n

【技术特征摘要】
1.一种食品中铜锌-超氧化物歧化酶酶活的检测方法，其特征在于，其包括以下步骤：
步骤1、制备待检测样品提取液，将该待检测样品提取液分为等量的两份，该两份分别为第一份样品提取液和第二份样品提取液；
步骤2、对第一份样品提取液以邻苯三酚自氧化法进行酶活测定，得到第一份样品提取液的铜锌-超氧化物歧化酶的酶活为U1；在第二份样品提取液中加入用于使酶完全失活的酶灭活剂，酶灭活剂为酶抑制剂和氨基酸的混合物，室温保存2.5小时以上后，用邻苯三酚自氧化法进行酶活测定，得到第二份样品提取液的伪酶活为U2；
步骤3、计算待检测样品提取液中铜锌-超氧化物歧化酶的酶活实际值U，U的计算公式为U＝U1-U2。


2.如权利要求1所述的食品中铜锌-超氧化物歧化酶酶活的检测方法，其特征在于，步骤2中，酶抑制剂为十二烷基三甲基氯化铵或盐酸胍，氨基酸为组氨酸、色氨酸或苯丙氨酸。


3.如权利要求2所述的食品中铜锌-超氧化物歧化酶酶活的检测方法，其特征在于，步骤2中，酶抑制剂为十二烷基三甲基氯化铵，氨基酸为色氨酸，酶灭活剂为色氨酸和十二烷基三甲基氯化铵的混合物，在第二份样品提取液中加入色氨酸和十二烷基三甲基氯化铵的混合物，至色氨酸和十二烷基三甲基氯化铵混合物的浓度大于或者等于10mmol/L。


4.如权利要求2所述的食品中铜锌-超氧化物歧化酶酶活的检测方法，其特征在于，步骤2中，酶抑制剂为十二烷基三甲基氯化铵，氨基酸为组氨酸，酶灭活剂为组氨酸和十二烷基三甲基氯化铵的混合物，在第二份样品提取液中加入组氨酸和十二烷基三甲基氯化铵的混合物，至组氨酸和十...

【专利技术属性】
技术研发人员：黄福伟，黄健翔，唐保国，
申请(专利权)人：上海净畅检测科技有限公司，
类型：发明
国别省市：上海;31