一种HSPG对胆道癌外周血CTC的分离鉴定及下游基因检测方法技术

本发明专利技术提供了一种HSPG对胆道癌外周血CTC的分离鉴定及下游基因检测方法，通过在外周血CTC中捕获肿瘤细胞进行分离鉴定，采用DNA提取试剂盒对样品进行DNA提取，采用高通量测序法进行胆道癌血液循环肿瘤细胞来源核酸的全基因组扩增、文库构建、测序数据过滤和质量评估、测序深度覆盖度统计、变异检测、关键变异鉴定等的过程方法，建立一整套高通量测序分析体系，获得肿瘤特异性分子信息用于提高特异度，通过特异性的分选抗体在血液中捕获肿瘤细胞，进而获悉释放的DNA携带的遗传信息的蛛丝马迹并加以检测分析，实现利用CTC来源核酸的基因表达水平变化与组织来源核酸的基因表达水平变化进行分析检测DNA的方法。

【技术实现步骤摘要】
一种HSPG对胆道癌外周血CTC的分离鉴定及下游基因检测方法
本专利技术涉及生物与医学检测
，尤其涉及到一种HSPG对胆道癌外周血CTC的分离鉴定及下游基因检测方法。
技术介绍
人外周血中的循环肿瘤细胞(CirculatingTumorCell，CTC)是指从肿瘤病灶播散进入外周血循环的肿瘤细胞，并在一定条件下可发展为肿瘤转移性病灶。由于超过90％的癌症死亡是由转移造成的，而CTC是肿瘤转移的直接来源，因此从血液中分离CTC并对其进行分子检测越来越引起人们的重视。外周血成分复杂，其中红细胞计数5.0～6.0×1012/mL,白细胞为4.0～10.0×106/mL，而循环肿瘤细胞可能只有0～100个。目前CTC的检测已从简单的细胞计数，扩展到下游簇分析、分子分型、基因、转录和蛋白层面检测的各个方向，在乳癌、结直肠癌、前列腺癌、肺癌已进入临床实用，但在胆道癌的诊治上仍有大量的空白。高通量测序技术(High-throughputsequencing)又称“下一代”测序技术(NGS)，已经对基础研究有很大的影响，正在革命性地改变临床的实践技术。NGS技术广泛应用于常规临床实践，包括无创产前检测(noninvasiveprenataltest，NIPT)和胚胎植入前遗传学诊断/筛查(preimplantationgeneticdiagnosis/preimplantationgeneticscreening，PGD/PGS)、遗传病、肿瘤、药物基因组等。NGS应用已经由基因组合向全外显子测序(wholeexomesequencing，WES)和全基因组测序(wholegenomesequencing，WGS)转变。肿瘤的NGS基因检测目前主要针对两类标本，一类是实体瘤组织的突变基因组panel测序，一类是外周血和尿液的液体活检。实体瘤组织NGS受限于肿瘤取材局限于某一时点，很难反复多次，检测结果对初诊初治患者的用药指导具有意义，但肿瘤发生发展、治疗有反应、肿瘤再进展甚至转移是会随着时间不断动态变化的。另外，一些转移的患者，可能组织取材非常困难，或只能来源于部分病灶，并不能反映患者的整体肿瘤情况；因此开展基于液体活检的CTC-NGS有很强的临床意义。硫酸乙酰肝素蛋白聚糖(Heparansulfateproteoglycan，HSPG)是由硫酸乙酰肝素链结合在核心蛋白上的一组糖蛋白，在细胞表面和细胞外基质中均有分布，基质HSPG主要与细胞浸润和迁徙有关；胞膜HSPG主要包括Syndecan和Glypican，功能涉及：作为生长因子的共同受体调节信号转导，与粘附分子共同调节细胞迁移，结合调节胞外基质金属蛋白酶活性等。在肿瘤发生与进展时，HSPG的含量、组分和功能出现异常，膜HSPG可与多种生长因子(如FGF、PDGF、EGF、HGF、IGF等)结合，激活相关通路。在低分化腺癌中HSPG含量升高，细胞分化程度低、伴有局部转移、临床分期晚期的GBC组织中HSPG硫酸化水平升高，硫酸化HSPG阳性患者化疗反应性更差，生存期更短，而目前针对HSPG总体表达在胆道癌中的研究较少。通过HSPG这一胆道癌特异性的分选抗体在外周血中捕获肿瘤细胞，进而获悉释放的DNA携带的遗传信息的蛛丝马迹并加以检测分析，实现利用无创的液体活检方式及时检测DNA的分析方法，因此，具有很大的优势和潜力。本专利技术提供了一种在临床研究中，选取胆道癌特异性的识别因子HSPG，对胆道癌患者外周血中循环肿瘤细胞进行特异性的分选及鉴定，并通过获得的CTC进行核酸的提取，完成CTC-DNA的高通量测序分析。研究胆道肿瘤外周血中CTC的动态变化指标与临床检测指标的相关性，及CTC来源核酸的基因表达水平变化与组织来源核酸的基因表达水平变化之间的一致性和差异性分析。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种胆道肿瘤血清中CTC特异性分选及鉴定检测的方法，选取胆道癌特异性的识别因子HSPG，对胆道癌患者外周血中循环肿瘤细胞进行特异性的分选及鉴定，并通过获得的CTC进行核酸的提取，完成CTC-DNA的高通量测序分析。研究胆道肿瘤外周血中CTC的动态变化指标与临床检测指标的相关性，及CTC来源核酸的基因表达水平变化与组织来源核酸的基因表达水平变化之间的一致性和差异性分析。本专利技术采用的技术方案如下：一种HSPG对胆道癌外周血CTC分离鉴定的方法，包括如下步骤：(1)取样：取来自胆道癌患者的外周血7.5mL置于抗凝管中并混匀全血标本；(2)对步骤(1)中采集的血样进行去除血浆蛋白及血浆(清)核酸，将全血中加入缓冲液，分层离心去除上清液后、轻摇离心管混匀沉淀细胞；(3)去除红细胞：混匀后，于离心管中加入裂解液，将离心管置于垂直混匀仪混匀，离心弃上清液，轻摇离心管混匀沉淀细胞后补加缓冲液；(4)分层离心：于新的离心管中加入分层液，将步骤(3)中的所有液体叠加到分层液顶层，然后用缓冲液清洗离心管管壁，将清洗液同时转移至缓冲液顶层离心；(5)去除白细胞：离心后可见3层溶液，轻柔吸取最上2层溶液于新的离心管内，分别加缓冲液，颠倒混匀后离心弃上清液，加入缓冲液，混匀沉淀细胞；(6)洗涤磁微粒：吸取适量免疫脂质磁球(已结合HSPG抗体)混悬液至EP管中，静置后吸弃溶液，加入缓冲液混匀，静置后弃上清液，重复3次后用缓冲液重悬磁微粒至原体积；(7)抗体孵育：将一定量的免疫脂质磁球(已结合HSPG抗体)缓慢加入步骤(6)处理好的样本中，调节摇床摇速，并将离心管倾斜固定于摇床上，室温摇动；(8)清除游离磁微粒：将步骤(7)中离心管液体转移至新的离心管中，靠于磁力架上静置，将液体分别转移至新的离心管中，架于离心管上端，离心弃上清液，分别涂至载玻片上；(9)将载玻片在室温下风干，滴加4％多聚甲醛固定细胞表面抗原，滴加1％胎牛血清封闭细胞表面非特异性位点；(10)将步骤(9)中血样富集后获得的载玻片分别加一抗工作液，避光孵育后，充分洗涤；(11)将步骤(10)中的样品加二抗工作液，避光孵育后，充分洗涤，加DAPI工作液染色后，轻微洗涤；(12)将步骤(11)中的样品滴甘油，盖片读片；并采用DNA提取试剂盒对样品进行CTC来源基于循环肿瘤细胞的DNA提取。优选的，所述的DNA提取试剂盒可采用QIAGEN试剂盒。优选的，所述的步骤(7)、(8)中抗体孵育和清除游离磁微粒对外周血的循环肿瘤细胞进行捕获的过程具体为：S1：对已接收的血液样本进行处理：取4mL血液加入至5mL离心管中，加入40μlHSPG免疫脂质磁球并颠倒混匀，室温下孵育20min；S2：将样本在磁力架上静置，捕获CTC的免疫脂质磁球会吸附在磁力架一侧，倒置磁力架和样本，洗下离心管盖上的样本。静置10分钟，吸弃澄清液；S3：加1mLddH2O清洗免疫脂质磁球；S4：加100ulCF1进行涂片，在37℃条件下烘干；S5：滴加4％多聚甲醛固定8min，随后在装有2×SSC的37℃的水浴锅中预热10m本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种HSPG对胆道癌外周血CTC分离鉴定的方法，其特征在于：包括如下步骤：/n(1)取样：取来自胆道癌患者的外周血7.5mL置于抗凝管中并混匀全血标本；/n(2)对步骤(1)中采集的血样进行去除血浆蛋白及血浆核酸，将全血中加入缓冲液，分层离心去除上清液后、轻摇离心管混匀沉淀细胞；/n(3)去除红细胞：混匀后，于离心管中加入裂解液，将离心管置于垂直混匀仪混匀，离心弃上清液，轻摇离心管混匀沉淀细胞后补加缓冲液；/n(4)分层离心：于新的离心管中加入分层液，将步骤(3)中的所有液体叠加到分层液顶层，然后用缓冲液清洗离心管管壁，将清洗液同时转移至缓冲液顶层离心；/n(5)去除白细胞：离心后可见3层溶液，轻柔吸取最上2层溶液于新的离心管内，分别加缓冲液，颠倒混匀后离心弃上清液，加入缓冲液，混匀沉淀细胞；/n(6)洗涤磁微粒：吸取适量免疫脂质磁球混悬液至EP管中，静置后吸弃溶液，加入缓冲液混匀，静置后弃上清液，重复3次后用缓冲液重悬磁微粒至原体积；/n(7)抗体孵育：将一定量的免疫脂质磁球缓慢加入步骤(6)处理好的样本中，调节摇床摇速，并将离心管倾斜固定于摇床上，室温摇动；/n(8)清除游离磁微粒：将步骤(7)中离心管液体转移至新的离心管中，靠于磁力架上静置，将液体分别转移至新的离心管中，架于离心管上端，离心弃上清液，分别涂至载玻片上；/n(9)将载玻片在室温下风干，滴加4％多聚甲醛固定细胞表面抗原，滴加1％胎牛血清封闭细胞表面非特异性位点；/n(10)将步骤(9)中血样富集后获得的载玻片分别加一抗工作液，避光孵育后，充分洗涤；/n(11)将步骤(10)中的样品加二抗工作液，避光孵育后，充分洗涤，加DAPI工作液染色后，轻微洗涤；/n(12)将步骤(11)中的样品滴甘油，盖片读片；并采用DNA提取试剂盒对样品进行CTC来源基于循环肿瘤细胞的DNA提取。/n...

【技术特征摘要】
1.一种HSPG对胆道癌外周血CTC分离鉴定的方法，其特征在于：包括如下步骤：
(1)取样：取来自胆道癌患者的外周血7.5mL置于抗凝管中并混匀全血标本；
(2)对步骤(1)中采集的血样进行去除血浆蛋白及血浆核酸，将全血中加入缓冲液，分层离心去除上清液后、轻摇离心管混匀沉淀细胞；
(3)去除红细胞：混匀后，于离心管中加入裂解液，将离心管置于垂直混匀仪混匀，离心弃上清液，轻摇离心管混匀沉淀细胞后补加缓冲液；
(4)分层离心：于新的离心管中加入分层液，将步骤(3)中的所有液体叠加到分层液顶层，然后用缓冲液清洗离心管管壁，将清洗液同时转移至缓冲液顶层离心；
(5)去除白细胞：离心后可见3层溶液，轻柔吸取最上2层溶液于新的离心管内，分别加缓冲液，颠倒混匀后离心弃上清液，加入缓冲液，混匀沉淀细胞；
(6)洗涤磁微粒：吸取适量免疫脂质磁球混悬液至EP管中，静置后吸弃溶液，加入缓冲液混匀，静置后弃上清液，重复3次后用缓冲液重悬磁微粒至原体积；
(7)抗体孵育：将一定量的免疫脂质磁球缓慢加入步骤(6)处理好的样本中，调节摇床摇速，并将离心管倾斜固定于摇床上，室温摇动；
(8)清除游离磁微粒：将步骤(7)中离心管液体转移至新的离心管中，靠于磁力架上静置，将液体分别转移至新的离心管中，架于离心管上端，离心弃上清液，分别涂至载玻片上；
(9)将载玻片在室温下风干，滴加4％多聚甲醛固定细胞表面抗原，滴加1％胎牛血清封闭细胞表面非特异性位点；
(10)将步骤(9)中血样富集后获得的载玻片分别加一抗工作液，避光孵育后，充分洗涤；
(11)将步骤(10)中的样品加二抗工作液，避光孵育后，充分洗涤，加DAPI工作液染色后，轻微洗涤；
(12)将步骤(11)中的样品滴甘油，盖片读片；并采用DNA提取试剂盒对样品进行CTC来源基于循环肿瘤细胞的DNA提取。


2.根据权利要求1所述的一种HSPG对胆道癌外周血CTC分离鉴定的方法，其特征在于：所述的步骤(7)、(8)中抗体孵育和清除游离磁微粒对外周血的循环肿瘤细胞进行捕获的过程具体为：
S1：对已接收的血液样本进行处理：取4mL血液加入至5mL离心管中，加入40μlHSPG免疫脂质磁球并颠倒混匀，室温下孵育20min；
S2：将样本在磁力架上静置，捕获CTC的免疫脂质磁球会吸附在磁力架一侧，倒置磁力架和样本，洗下离心管盖上的样本。静置10分钟，吸弃澄清液；
S3：加1mLddH2O清洗免疫脂质磁球；
S4：加100ul的CF1进行涂片，在37℃条件下烘干；
S5：滴加4％多聚甲醛固定8min，随后在装有2×SSC的37℃的水浴锅中预热10min；
S6：分别选用75％、85％和无水乙醇进行脱水，分别进行2min。并在室温下风干；
S7：加10ul荧光探针并封片，随后置于杂交仪中76℃杂交10min，并在37℃杂交1.5h；
S8：用镊子撕去封片胶，放入甲酰胺(43℃)中，脱落盖玻片，浸洗10min，再采用2×SSC浸洗15min，并每5min摇晃一次；
S9：在样本区涂100ul的CK荧光抗体染色液，并在37℃湿盒避光条件下孵育1h；
S10：洗弃CK荧光抗体染色液，用0.2％BSA洗两次后，加10ulDAPI盖片读片。


3.根据权利要求1所述的一种HSPG对胆道癌外周血CTC分离鉴定的方法，其特征在于：所述步骤(13)中的采用DNA提取试剂盒进行循环肿瘤细胞的DNA提取的过程具体为：
(a)向10ml的血液中加入2.5倍体积的SolutionA，颠倒混匀，8000rpm离心5分钟，弃掉上清液；
(b)重复进行1-2次步骤a，弃掉上清液；
(c)按照DNA提取试剂盒附表提供的信息配制SolutionB与SolutionC的混合液；
(d)加入5ml的SolutionB与SolutionC的混合液，用一次性塑料吸管吹打均匀，60℃水浴或孵箱孵育10分钟，孵育期间颠倒混匀一次，溶液由红色变为黄绿色或棕色；
(e)加入等体积的异丙醇，充分颠倒混匀至出现丝状或絮状DNA；
(f)用移液器将絮状物移到加有800ul的75％酒精的1....

【专利技术属性】
技术研发人员：易滨，袁磊，吴英俊，姜小清，
申请(专利权)人：中国人民解放军海军军医大学第三附属医院，
类型：发明
国别省市：上海;31