一种食物中红霉素残留检测方法技术

本发明专利技术属于红霉素残留检测技术领域，公开了一种食物中红霉素残留检测方法，包括以下步骤：步骤一、红霉素试剂盒准备，采用96孔聚苯乙烯试剂板作为固相载体，放入真空铝箔袋内，在试剂盒酶标板微孔中预包被红霉素偶联抗原制成检测板，以塑料硬膜为盖板膜。本发明专利技术提供的红霉素残留检测试剂盒小巧轻便，便于携带和运输，且检测方法操作简便，检测快速、准确、灵敏度高，成本低，稳定性好，需要的技术含量不高，可进行一次连续多个样品中红霉素含量的测定，减少了检验样本所需要的时间，可用于临床、药物、食品和环境等分析领域，且所需仪器较少，只需要酶标仪、匀质器、振荡器和微量加样器，普通实验室一般均有配备，所需成本较低。

【技术实现步骤摘要】
一种食物中红霉素残留检测方法
本专利技术涉及红霉素残留检测
，具体为一种食物中红霉素残留检测方法。
技术介绍
红霉素是由红霉素链霉菌产生的大环内酯系的代表性抗菌素。作用机制在于其主要与核糖核蛋白体的50s亚单位相结合，抑制肽酰基转移酶，影响核糖核蛋白体的移位过程，妨碍肽链增长，抑制细菌蛋白质的合成，是抑菌剂。因此广泛应用于畜禽、水产养殖中的细菌性疾病的治疗和防治。由于红霉素在动物体内代谢时间较长，因此不可避免地在动物体内产生残留，给人畜带来危害。同时，红霉素经动物体代谢后大部分以母体化合物或代谢体的形式经动物粪便和尿液排出体外，进入环境介质。水中的沉积物是红霉素的主要富集场所，水生动植物(如水草、斑马鱼等)也对红霉素表现出一定的吸收富集能力，通过食物链被人体吸收后蓄积在肝、肾中，给人类带来毒副作用，如腹泻、恶心、呕吐、过敏反应等。虽然目前红霉素在环境水样中的最大残留限量没有明确规定，但我国农业部235号公告和欧盟CE1181/2002规定红霉素在动物组织中的最大残留限量为200ug/kg，另外美国规定猪可食性组织中的红霉素最高残留限量为100ug/kg，日本规定水生动物中红霉素最高残留限量为200ug/kg。目前，红霉素残留检测主要应用高效液相色谱法(HPμLC)，气相色译法(GC)往往需要衍生化，增加了操作的繁琐性且灵敏度也不高，近年来，液相色谱-串取质谱法(μLC-IS/MS)用于红霉素的检测，虽然灵敏度较高，但仪器昂贵，前处理复杂及需要专业人员操作等因素也局限了其在现场检验，样品筛选中的应用。
技术实现思路
(一)解决的技术问题1.要解决的技术问题针对现有技术中存在的问题，本专利技术的目的在于提供一种食物中红霉素残留检测方法，解决了上述问题。(二)技术方案为实现上述目的，本专利技术提供如下技术方案：一种食物中红霉素残留检测方法，包括以下步骤：步骤一、红霉素试剂盒准备：采用96孔聚苯乙烯试剂板作为固相载体，放入真空铝箔袋内，在试剂盒酶标板微孔中预包被红霉素偶联抗原制成检测板，以塑料硬膜为盖板膜，另外包含30mμL浓缩洗涤液、5mμL样品提取液A、样品提取液B、12mμL酶标二抗、6mμL红霉素抗体工作液、12mμL显色液TMB、12mμL终止液和6瓶1mμL不同浓度的红霉素标准品溶液及1瓶1mμL高浓度标准品溶液，试剂用不同大小、不同颜色的塑料瓶和玻璃瓶盛装并固定在泡沫塑料模具中与检测板、盖板膜一同封装在盒内，以便于携带和运输；步骤二、1x洗液的制备：1体积的20x洗液同19体积的蒸馏水混合检测：①加入50μL的标准液或样品于所设定的孔中；②在每孔中加入50μL酶标二抗，再在每孔中加50μL一抗体工作液；轻敲微孔板边缘混匀60秒；③室温(20-25℃)孵育30分钟；④洗板4次，每次加入260μL1×洗液，最后一次使板尽量甩干并在吸水纸上吸干；⑤加入100μL的TMB底物，轻轻震板1分钟。⑥在室温下避光孵育15分钟，加入50μL的终止液终止反应，在450nm下读OD值；步骤三、结果计算：①分别计算标准和样品的平均吸光度值和相对吸光度值；②相对吸光度值(％)＝(标准或样品吸光度值/零标准吸光度值)100％；③以相对吸光度值为纵坐标，标准浓度的对数为横坐标建立标准曲线；④从标准曲线上读取样品的浓度值。优选的，步骤一所述试剂在使用之前要在室温下解冻1-2小时，确定在使用前阅读过注意事项，准备适量的检测用试剂，所有的试剂摇匀后使用，准备足够所有小管所需的用量，不能将试剂倒回原来的瓶子中，处理试剂时建议用专用回收的瓶子以降低污染的风险。优选的，所述样品在检测前需要进行前处理，所述样品包括水样、组织样本和鲜奶，所述水样为1×PBS：1体积(10×PBS)：9体积(蒸馏水)水样，所述组织样本包括鸡肉、鸭肉、猪肉、猪肝、鱼虾等。优选的，所述样品保存在2-4℃不超过1-2天，如果需要保存较长的时间，应放置-20℃环境中，样品使用前恢复到室温。优选的，所述水样的前处理具体步骤为：①取2mμL水样，用酸或者碱调pH到6-7；②取1.0mμL上述调好的水样加入3mμL30％甲醇/70％1XPBS；③最大转速漩涡振荡1min；④每孔取50μL上清进行检测；稀释倍数：4。优选的，所述组织样本的前处理具体步骤为：①除去脂肪，匀质样品；②称取1g的样品，加入2.9mμL30％甲醇/70％1XPBS，加入50μL样品提取液A，摇匀5秒后加入50μL样品提取液B，涡旋30秒；③最大转速漩涡振荡3min；④室温(22.5±2.5)℃、4000rpm离心5分钟；⑤室温下4000xg离心4分钟；⑥每孔取50μL上清进行检测；稀释倍数：8。优选的，所述鲜奶的前处理具体步骤为：①1.0mμL鲜奶样品加入50μL样品提取液A，摇匀5秒后加入50μL样品提取液B，涡旋30秒；②最大速度涡旋30秒；③4000xg在室温(20–25℃(68–77°F))离心5分钟；④取上清50μL加350μL30％甲醇/70％1XPBS，最大速度涡旋30秒；⑤每孔取50μL上清进行检测；稀释倍数：8.8。(三)有益效果与现有技术相比，本专利技术提供了一种食物中红霉素残留检测方法，具备以下有益效果：(1)本专利技术提供的红霉素残留检测试剂盒小巧轻便，便于携带和运输，且检测方法操作简便，检测快速、准确、灵敏度高，成本低，稳定性好，需要的技术含量不高，可进行一次连续多个样品中红霉素含量的测定，减少了检验样本所需要的时间、分析快速的优点，可用于临床、药物、食品和环境等分析领域，且所需仪器较少，只需要酶标仪、匀质器、振荡器和微量加样器，普通实验室一般均有配备，所需成本较低。(2)红霉素试剂盒基于竞争性酶联免疫原理，抗原包被在酶标板孔内，分析过程中，样品和一抗、酶标二抗加入微孔中，如果样品中有红霉素，就可竞争与抗体结合，阻止抗体与包被的抗原结合，酶标二抗可与一抗结合从而与酶标板上包被的抗原结合，经酶催化底物发生反应，出现颜色变化，颜色的深浅与红霉素的浓度成反比。(3)经实验表明本试剂盒具有很高的灵敏度:水样本的最低检测限为0.2ppb，组织样本的最低检测限为0.4ppb，牛奶最低检测限为0.44ppb；鸡肉、鸭肉、猪肉、猪肝、鱼虾的回收率为95％±5％、牛奶的回收率为100％±5％；硫氰酸红霉素的交叉反应率为110％、琥乙红霉素的交叉反应率为68％,卡那霉素的交叉反应率为＜0.1％、替米考星的交叉反应率为<0.1％,泰乐菌素的交叉反应率为-0.1％相对于其他红霉素残留检测方法。附图说明：图1为红霉素酶联免疫反应测试盒的典型标准曲线图。具体实施方式下面将结合本专利技术的实施例，对本本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种食物中红霉素残留检测方法，其特征在于：包括以下步骤：/n步骤一、红霉素试剂盒准备：采用96孔聚苯乙烯试剂板作为固相载体，放入真空铝箔袋内，在试剂盒酶标板微孔中预包被红霉素偶联抗原制成检测板，以塑料硬膜为盖板膜，另外包含30mμL浓缩洗涤液、5mμL样品提取液A、样品提取液B、12mμL酶标二抗、6mμL红霉素抗体工作液、12mμL显色液TMB、12mμL终止液和6瓶1mμL不同浓度的红霉素标准品溶液及1瓶1mμL高浓度标准品溶液，试剂用不同大小、不同颜色的塑料瓶和玻璃瓶盛装并固定在泡沫塑料模具中与检测板、盖板膜一同封装在盒内，以便于携带和运输；/n步骤二、1x洗液的制备：/n1体积的20x洗液同19体积的蒸馏水混合检测：/n①加入50μL的标准液或样品于所设定的孔中；/n②在每孔中加入50μL酶标二抗，再在每孔中加50μL一抗体工作液；轻敲微孔板边缘混匀60秒；/n③室温(20-25℃)孵育30分钟；/n④洗板4次，每次加入260μL 1×洗液，最后一次使板尽量甩干并在吸水纸上吸干；/n⑤加入100μL的TMB底物，轻轻震板1分钟。/n⑥在室温下避光孵育15分钟，加入50μL的终止液终止反应，在450nm下读OD值；/n步骤三、结果计算：/n①分别计算标准和样品的平均吸光度值和相对吸光度值；/n②相对吸光度值(％)＝(标准或样品吸光度值/零标准吸光度值)100％；/n③以相对吸光度值为纵坐标，标准浓度的对数为横坐标建立标准曲线；/n④从标准曲线上读取样品的浓度值。/n...

【技术特征摘要】
1.一种食物中红霉素残留检测方法，其特征在于：包括以下步骤：
步骤一、红霉素试剂盒准备：采用96孔聚苯乙烯试剂板作为固相载体，放入真空铝箔袋内，在试剂盒酶标板微孔中预包被红霉素偶联抗原制成检测板，以塑料硬膜为盖板膜，另外包含30mμL浓缩洗涤液、5mμL样品提取液A、样品提取液B、12mμL酶标二抗、6mμL红霉素抗体工作液、12mμL显色液TMB、12mμL终止液和6瓶1mμL不同浓度的红霉素标准品溶液及1瓶1mμL高浓度标准品溶液，试剂用不同大小、不同颜色的塑料瓶和玻璃瓶盛装并固定在泡沫塑料模具中与检测板、盖板膜一同封装在盒内，以便于携带和运输；
步骤二、1x洗液的制备：
1体积的20x洗液同19体积的蒸馏水混合检测：
①加入50μL的标准液或样品于所设定的孔中；
②在每孔中加入50μL酶标二抗，再在每孔中加50μL一抗体工作液；轻敲微孔板边缘混匀60秒；
③室温(20-25℃)孵育30分钟；
④洗板4次，每次加入260μL1×洗液，最后一次使板尽量甩干并在吸水纸上吸干；
⑤加入100μL的TMB底物，轻轻震板1分钟。
⑥在室温下避光孵育15分钟，加入50μL的终止液终止反应，在450nm下读OD值；
步骤三、结果计算：
①分别计算标准和样品的平均吸光度值和相对吸光度值；
②相对吸光度值(％)＝(标准或样品吸光度值/零标准吸光度值)100％；
③以相对吸光度值为纵坐标，标准浓度的对数为横坐标建立标准曲线；
④从标准曲线上读取样品的浓度值。


2.根据权利要求1所述的一种食物中红霉素残留检测方法，其特征在于：步骤一所述试剂在使用之前要在室温下解冻1-2小时，确定在使用前阅读过注意事项，准备适量的检测用试剂，所有的试剂摇匀后使用，准备足够所有小管所需的用量，不能将试剂倒回原来的瓶子中。


3.根据权利要求1所述的一种食物中红霉素残留检测方法，其特征在于...

【专利技术属性】
技术研发人员：邓兴朝，陈欢，童小倩，林金昌，曾祥富，
申请(专利权)人：深圳容金科技有限公司，
类型：发明
国别省市：广东;44