一种以去铁蛋白为载体制备紫杉醇纳米药物并回收紫杉醇的方法技术

本发明专利技术涉及一种制备以去铁蛋白为载体的紫杉醇纳米药物并回收紫杉醇的方法。紫杉醇是目前已发现的最优秀的天然广谱、高效的抗肿瘤药，但因其水溶性差、缺乏靶向性限制了其在临床上的应用。去铁蛋白是由24个蛋白亚基自组装形成的中空笼状蛋白，该纳米笼状蛋白可通过蛋白亚基的解聚重组将紫杉醇载入其中形成以去铁蛋白为载体的紫杉醇纳米药物，该方法可有效提高紫杉醇的水溶性，增加紫杉醇的靶向性，在精准高效治疗癌症等方面具有极大的应用前景。在制备紫杉醇纳米药物时，由于装载率较低，价格昂贵的紫杉醇因无法回收而被浪费。本发明专利技术提供了一种在制备紫杉醇纳米药物后回收紫杉醇的方法，可大大降低制备成本，实现紫杉醇的回收再利用。

【技术实现步骤摘要】
一种以去铁蛋白为载体制备紫杉醇纳米药物并回收紫杉醇的方法
本专利技术属生物医药
，具体涉及一种以去铁蛋白为载体制备紫杉醇纳米药物并回收紫杉醇的方法。
技术介绍
癌症依然是造成人类死亡的重要原因，而化疗是临床治疗癌症最有效的手段之一，使用优秀的化疗药物是化疗成功的关键。紫杉醇是一种广谱、高效的抗癌药物，是目前已发现的最优秀的天然抗肿瘤药物，在临床上已经广泛用于乳腺癌、卵巢癌和部分头颈癌和肺癌等癌症的治疗。但是由于紫杉醇水溶性极差，市售紫杉醇注剂主要采用聚氧乙烯蓖麻油与乙醇等体积比混溶增加紫杉醇的水溶性，但聚氧乙烯蓖麻油在人体内会产生严重的毒副作用；且由于紫杉醇缺乏靶向性，该注剂对其它正常细胞、器官、组织也会造成严重的不良影响。去铁蛋白是由24个蛋白亚基自组装形成纳米中空笼状结构，该纳米笼水溶性好、生物相容性强，体内稳定性佳，尺寸均一且理想，且该去铁蛋白本身具有靶向性，可与肿瘤细胞中过量表达的转铁蛋白受体1(TfR1)特异性结合。此外该蛋白可通过调节蛋白亚基的解聚与重组，使紫杉醇载入纳米笼中形成以去铁蛋白为载体的紫杉醇纳米药物，该紫杉醇纳米药物大大提高了紫杉醇的水溶性，增强了紫杉醇的靶向性，是理想的纳米药物。但在制备以去铁蛋白为载体的紫杉醇纳米药物时，紫杉醇的装载率较低，一般为12％-18％，大多数紫杉醇因未被利用而被浪费，造成制备紫杉醇纳米药物的成本增高。因此回收未被利用的紫杉醇是降低成本的关键。
技术实现思路
本专利技术的目的是为了提高紫杉醇的水溶性，增加紫杉醇的靶向性，缓解对人体的不良反应，尽可能的降低紫杉醇对正常细胞、器官、组织的毒副作用，而提供的一种以去铁蛋白为载体的紫杉醇纳米药物，不仅将紫杉醇水溶性提高至100％，而且能与TfR1特异性结合并在TfR1的介导下进入肿瘤细胞，有效的抑制肿瘤细胞的生长、迁移、扩散，可大大提高癌症的治疗效果，实现癌症的靶向治疗、精准治疗。此外在制备紫杉醇纳米药物的过程中，回收未被利用的紫杉醇，大大降低了制备该纳米药物的成本，实现了紫杉醇的回收再利用。解决上述技术问题，本专利技术提供以下技术方案：本专利技术提供一种以去铁蛋白为载体的紫杉醇纳米药物的制备方法，所述方法包括以下步骤：(1)克隆表达去铁蛋白；(2)分离纯化去铁蛋白；(3)制备以去铁蛋白为载体的紫杉醇纳米药物并回收未被利用的紫杉醇优选地，步骤(1)所述的铁蛋白制备方法包括以下步骤：a.构建去铁蛋白笼表达工程菌：将去铁蛋白编码基因克隆至质粒载体中，并转化至感受态细胞。通过抗生素抗性筛选阳性单克隆转化子，获得表达去铁蛋白的工程菌；b.表达去铁蛋白：将表达去铁蛋白的工程菌接种至培养基中，待菌液OD600值达到一定值时，加入IPTG诱导表达，离心收集菌体。优选地，步骤a所述工程菌通过大肠杆菌异源表达去铁蛋白；优选地，步骤a中质粒载体为pET-20b(+)；优选地，步骤a中抗生素为氨苄青霉素。优选地，步骤b所述的OD600值为0.6-0.8；优选地，步骤b中所述的IPTG终浓度为0.5mM；优选地，步骤b中所述的诱导温度为30℃；优选地，步骤b中所述的诱导时间为6-8h；优选地，步骤b中所述的离心转速为10000rpm；优选地，步骤b中所述的离心时间为30min。优选地，步骤(2)中分离纯化去铁蛋白主要包括以下步骤：c.将收集的表达目的蛋白的工程菌破碎，收集上清，热处理上清液后再次离心，获得上清即为粗品去铁蛋白；d.将粗品蛋白通过纯化获得精品蛋白。优选地，其特征在于，步骤c所述的破碎为超声破碎；优选地，步骤c所述的破碎时间为30min；优选地，步骤c所述的热处理温度为60℃；优选地，步骤c所述的热处理时间为10min；优选地，步骤c所述的离心转速均为10000rpm；优选地，步骤c所述的离心时间均为30min。优选地，步骤d中所述层析为亲和层析和凝胶过滤层析；优选地，步骤d所述的层析柱为镍柱和Superdex200凝胶过滤层析柱。优选地，步骤(3)中制备以去铁蛋白为载体的紫杉醇纳米药物主要包括以下步骤：e.将去铁蛋白溶液与紫杉醇溶液按照一定摩尔比混溶，调节溶液pH至2.5-3，缓慢搅拌，再次将溶液pH调至7.0-7.5，获得去铁蛋白-紫杉醇、游离紫杉醇、变性的去铁蛋白等混合溶液；f.将e中最终获得的混合溶液平均分成若干组，分别置于透析袋中透析不同时间，将混合溶液取出，离心后将上清继续透析，累积透析一定时间，检测紫杉醇纳米药物中紫杉醇的量并计算包封率。包封率＝包封至去铁蛋白笼中的紫杉醇量/紫杉醇总量*100％g.将离心获得的沉淀物溶于有机溶剂，震荡充分混合，离心取上清，检测上清中紫杉醇的量。将上清中有机溶剂除去，获得紫杉醇纯品。优选地，步骤e中所有过程均在4℃下进行，所有过程均缓慢搅拌；优选地，步骤e所述的紫杉醇溶液为紫杉醇溶解于无水乙醇的溶液；优选地，步骤e所述的摩尔比为1∶200；优选地，步骤e所述的搅拌时间为10min。优选地，步骤f中将上清再次调节pH至2.5-3，再次离心，取部分上清使用HPLC检测去铁蛋白-紫杉醇中紫杉醇的量；优选地，步骤f所述透析袋的截留值为6-8kDa；优选地，步骤f所述的透析时间为18h；优选地，步骤f所述的离心转速为6000rpm；优选地，步骤f所述的离心时间为10min。优选地，步骤g所述有机溶剂为无水乙醇；优选地，步骤g所述离心转速为10000rpm；优选地，步骤g所述离心时间为10min；优选地，步骤g所述去除有机溶剂的方法为真空干燥。作为优选技术方案，本专利技术所述以去铁蛋白为载体的紫杉醇纳米药物的制备方法包括以下步骤：克隆表达去铁蛋白：将去铁蛋白编码基因克隆至pET-20b(+)质粒载体中，并转化至大肠杆菌感受态细胞。通过氨苄青霉素筛选阳性单克隆转化子，获得表达去铁蛋白的工程菌；表达重组蛋白，将表达去铁蛋白的工程菌接种至含有氨苄青霉素的LB培养基中，待菌液OD600值达0.6-0.8时，加入IPTG诱导表达，离心收集菌体。分离纯化去铁蛋白：将表达去铁蛋白的工程菌破碎后，离心收集上清，上清液在60℃下热处理10min，再次离心取上清，经镍柱亲和层析和凝胶过滤层析得纯品去铁蛋白。将去铁蛋白溶液与溶于无水乙醇等溶剂的紫杉醇按摩尔比1∶200混合，调节混合溶液pH至2.5缓慢搅拌10min后，重新调节溶液pH至7.0-7.5，获得以去铁蛋白为载体的紫杉醇纳米药物物、游离紫杉醇、变性去铁蛋白等混合溶液。将该混合溶液置于透析袋中透析除去游离的紫杉醇，透析12-18h后取出，6000rpm离心10min，上清即为以铁蛋白为载体的紫杉醇纳米药物，通过HPLC检测该紫杉醇纳米药物中紫杉醇的含量。使用有机溶剂无水乙醇等将透析所得本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种制备以去铁蛋白为载体的紫杉醇纳米药物并回收紫杉醇的方法，其特征在于，制备的步骤为：将去铁蛋白溶液与紫杉醇溶液混溶，调节溶液pH至2.5-3.0，搅拌后再次将溶液pH调至7.0-7.5，获得去铁蛋白-紫杉醇、游离紫杉醇、变性的去铁蛋白的混合溶液；将获得的混合溶液，置于透析袋中透析，将透析样品取出离心，上清即为以去铁蛋白为载体紫杉醇纳米药物。利用无水乙醇等重悬沉淀，充分震荡再次离心，去除上清中有机溶剂即得紫杉醇。/n

【技术特征摘要】
1.一种制备以去铁蛋白为载体的紫杉醇纳米药物并回收紫杉醇的方法，其特征在于，制备的步骤为：将去铁蛋白溶液与紫杉醇溶液混溶，调节溶液pH至2.5-3.0，搅拌后再次将溶液pH调至7.0-7.5，获得去铁蛋白-紫杉醇、游离紫杉醇、变性的去铁蛋白的混合溶液；将获得的混合溶液，置于透析袋中透析，将透析样品取出离心，上清即为以去铁蛋白为载体紫杉醇纳米药物。利用无水乙醇等重悬沉淀，充分震荡再次离心，去除上清中有机溶剂即得紫杉醇。


2.根据权利要求1所述的制备以去铁蛋白为载体的紫杉醇纳米药物并回收紫杉醇的方法，其特征在于所述去铁蛋白为人重链铁蛋白。


3.根据权利要求2所述的制备以去铁蛋白为载体的紫杉醇纳米药物并回收紫杉醇的方法，其特征在于所述人重链铁蛋白的氨基酸序列如SEQIDNO.2所示，核酸序列如S...

【专利技术属性】
技术研发人员：张瑜，李瑞珂，赵竹君，熊又沣，黄申林，李迅，王飞，
申请(专利权)人：南京林业大学，
类型：发明
国别省市：江苏;32