一种快速诊断蜜蜂丝状病毒试纸及其应用制造技术

本发明专利技术提供了一种蜜蜂丝状病毒抗体胶体金快速检测试剂条，包括支撑层，以及在所述支撑层上依次设置的加样垫、金标抗体释放垫、检测层和吸收层，所述金标抗体释放垫包埋有胶体金标记的抗蜜蜂丝状病毒囊膜蛋白的鼠源多克隆抗体；所述检测层上设置有检测带和质控带，所述检测带固定有抗蜜蜂丝状病毒囊膜蛋白的兔源多克隆抗体，所述质控带固定有蜜蜂丝状病毒囊膜蛋白抗原。本发明专利技术的试纸条特异性强，极大的降低了出现假阳性的概率，保证了试纸条特异性和灵敏度；安全性高，避免检测过程中复杂的病毒处理操作；操作简便快捷，本发明专利技术不需要专业的技术人员进行操作和专业仪器的辅助检测，检测结果直观易判定并且检测时间只需20min极为迅速。

A rapid diagnostic test paper for bee filovirus and its application

【技术实现步骤摘要】
一种快速诊断蜜蜂丝状病毒试纸及其应用
本专利技术属于兽医生物
，涉及胶体金以及金标抗体复合物，尤其涉及蜜蜂丝状病毒囊膜蛋白抗体的检测试纸条，同时还涉及该试纸条的制备方法以及应用。
技术介绍
蜜蜂丝状病毒（Apismelliferafilamentousvirus，AmFV），最初被误认为是蜜蜂立克次氏体病，随着后来进一步的研究发现它是一个大的囊膜双链DNA(dsDNA)病毒。其丝状核蛋白折叠成三个重叠的“8”环状，形成一个450nm×170nm的病毒粒子。由于蜜蜂丝状病毒（AmFV）具有基因组大、隐性感染、流行广泛等特点，近年来逐渐受到各国科学家的关注。但该病毒的研究进展缓慢，2015年才完成第一株（瑞士株）基因组的测序工作。病毒蛋白主要包括核衣壳蛋白和囊膜蛋白。AmFV感染的一个主要诊断特征是，严重感染的成年蜜蜂的血淋巴由于细胞降解和大量病毒粒子的存在而变成奶白色。AmFV已在美国、英国、瑞士、法国、墨西哥、叙利亚、非洲、中国等地区的意大利蜜蜂及中国地区的中华蜜蜂中被报道，并都具有较高的流行率。另有报道称蜜蜂丝状病毒在中国意大利蜜蜂的流行率（90%）明显高于在中华蜜蜂中的流行率（52%）。分子诊断表明，AmFV病毒在蜜蜂蜂群中是广泛存在的，既可以通过食物交换进行水平传播，又可以通过蜂王到子代工蜂的垂直传播。目前，对于AmFV的检测主要是通过对蜜蜂血淋巴样品的电子显微镜检查和聚合酶链式反应(PolymeraseChainReaction，PCR）。这些方法存在一些较难克服的缺点，例如：PCR法需要若干个试剂、且需要特殊的仪器，检测步骤较为繁琐，检测所需的时间较长，而显微镜检测过程中还需其它设备与仪器，并且对于在实地情况下的蜂农来说，对技术要求也是一个重要的难题，整体所需的花费也较高。因此迫切需要建立一种省时省力又可以迅速普及的检测方法。因此，开发建立一种可以对蜜蜂丝状病毒抗体检测快速有效的方法是十分必要的。目前没有任何关于蜜蜂丝状病毒的抗体检测法，而免疫胶体金技术是20世纪80年代继荧光标记、放射性同位素标记和酶标记三大标记技术后发展起来的固相标记免疫测定技术，目前已广泛应用于临床诊断,尤其是在医学、兽医学临床检验中已广泛应用，具有费用低、灵敏度高、检测速度快、使用便捷和易于普及等特点。
技术实现思路
为了解决上述问题，本专利技术提供一种蜜蜂丝状病毒（AmFV）抗体胶体金快速检测试纸条。本专利技术提供的检测纸条，其包括支撑层，以及在所述支撑层上依次设置的加样垫、金标抗体释放垫、检测层和吸收层，所述金标抗体释放垫包埋有胶体金标记的抗蜜蜂丝状病毒囊膜蛋白的鼠源多克隆抗体；所述检测层上设置有检测带和质控带，所述检测带固定有抗蜜蜂丝状病毒囊膜蛋白的兔源多克隆抗体，所述质控带固定有蜜蜂丝状病毒囊膜蛋白。所述蜜蜂丝状病毒囊膜蛋白序列如序列表中序列2所示。所述蜜蜂丝状病毒囊膜蛋白是将序列表中序列1所示的核苷酸片段插入到表达载体中表达后纯化得到所述蜜蜂丝状病毒囊膜蛋白白；所述表达载体优选为PET-28a载体。其中，所述的支撑层优选为聚乙烯纤维板，更优选为聚氯乙烯板（PolyvinylchloridPVC板），其中，所述的加样垫优选为中速定性滤纸。其中，所述的金标抗体释放垫优选为玻璃纤维素膜，更优选为Rapid27（美国Whatman）的玻璃纤维素膜。其中，所述的检测层优选为硝酸纤维素膜，更优选为FF85系列（美国Whatman）的硝酸纤维素膜。其中，所述的吸收层优选为玻璃纤维，更优选为玻璃纤维CF4（美国Whatman）。本专利技术还提供一种制备所述检测试纸条的方法，其包括如下步骤：1）在检测层的不同位置上分别固定抗蜜蜂丝状病毒囊膜蛋白PIF2的兔源多克隆抗体以及蜜蜂丝状病毒囊膜蛋白，形成检测带和质控带；2）制备金标抗体释放垫；3）组装支撑层、加样垫、金标抗体释放垫、检测层和吸收层。其中，制备金标抗体释放垫包括如下步骤：以1:100~3000的标记比例将待标记的抗蜜蜂丝状病毒囊膜蛋白PIF2的鼠源多克隆抗体加入到pH7.0~10.0胶体金溶液中，按1:10~500的比例用含0.1~5%BSA的0.001~0.1mol/L磷酸盐缓冲液（PB）稀释胶体金标记的抗蜜蜂丝状病毒囊膜蛋白的鼠源多克隆抗体，将稀释后的胶体金标记的抗蜜蜂丝状病毒囊膜蛋白的鼠源多克隆抗体液按60μL/cm2的速度喷于玻璃纤维素膜中，4℃低温真空干燥。其中，将包被浓度为0.1~1mg/mL，优选为0.2~0.8mg/mL，更优选为0.5mg/mL的抗蜜蜂丝状病毒囊膜蛋白的兔源多克隆抗体按1μL/cm的速度喷于检测层上作为检测带，将包被浓度为0.1~5mg/mL，优选为0.5~2mg/mL，更优选为1mg/mL的蜜蜂丝状病毒囊膜蛋白按1μL/cm的速度喷于检测带下方的检测层上作为质控带，37℃下干燥30min，从而制备检测层。与传统的PCR等方法相比，本方明的试纸条具有明显的优越性：特异性强，使用原核表达病毒囊膜蛋白，极大的降低了出现假阳性的概率，保证了试纸条特异性和灵敏度；安全性高，避免检测过程中病毒的操作；操作简便快捷，本专利技术不需要专业的技术人员进行操作和专业仪器的辅助检测，检测结果直观易判定并且检测时间只需10min极为迅速。附图说明图1为蜜蜂丝状病毒囊膜蛋白抗体胶体金快速检测试纸条的结构示意图。其中，1为加样垫，2为胶体金标记的金标抗原释放垫，3为质控带，抗原层，4为吸收层，5为检测带，多抗层，6为支撑层。具体实施方式以下参照具体的实施例来说明本专利技术。本领域技术人员能够理解，这些实施例仅用于说明本专利技术，其不以任何方式限制本专利技术的范围。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的药材原料、试剂材料等，如无特殊说明，均为市售购买产品。实施例1、蜜蜂蜜蜂丝状病毒囊膜蛋白抗体胶体金快速检测试纸条的制备如图1所示，本专利技术的蜜蜂丝状病毒囊膜蛋白抗体胶体金快速检测试纸条，包括支撑层6，以及在所述支撑层上依次设置的加样垫1、金标抗原释放垫2、检测层和吸收层4；其中，所述金标抗体释放垫包埋有胶体金标记的抗蜜蜂丝状病毒囊膜蛋白的鼠源多克隆抗体；所述检测层上设置有检测带5和质控带3，所述检测带固定有抗蜜蜂丝状病毒囊膜蛋白的兔源多克隆抗体，所述质控带固定有蜜蜂丝状病毒囊膜蛋白。蜜蜂丝状病毒囊膜蛋白抗体胶体金快速检测试纸条按照下述方法制备：一、蜜蜂丝状病毒囊膜蛋白的表达与纯化所述蜜蜂丝状病毒囊膜蛋白按照下述方法获得：根据蜜蜂丝状病毒囊膜蛋白PIF2的核苷酸序列为基础，采用Primer5.0软件设计了扩增引物，其上下游引物分别为：F：5’GCGGATCCGGGTTCTCGCGCGACATGTACTCG'，R：5’CCCAAGCTTCGCGACAGGCGAGAACACGCCGACCTTCTG3'，其扩增产物大小为1008bp。然后根据已检测的蜜蜂丝状病毒阳性样品，采用本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种蜜蜂丝状病毒抗体胶体金快速检测试纸条，包括支撑层，以及在所述支撑层上依次设置的加样垫、金标抗体释放垫、检测层和吸收层，其特征在于，所述金标抗体释放垫包埋有胶体金标记的抗蜜蜂丝状病毒囊膜蛋白的鼠源多克隆抗体；所述检测层上设置有检测带和质控带，所述检测带固定有抗蜜蜂丝状病毒囊膜蛋白的兔源多克隆抗体，所述质控带固定有蜜蜂丝状病毒囊膜蛋白；其中，蜜蜂丝状病毒囊膜蛋白的序列如序列表中序列2所示。/n

【技术特征摘要】
1.一种蜜蜂丝状病毒抗体胶体金快速检测试纸条，包括支撑层，以及在所述支撑层上依次设置的加样垫、金标抗体释放垫、检测层和吸收层，其特征在于，所述金标抗体释放垫包埋有胶体金标记的抗蜜蜂丝状病毒囊膜蛋白的鼠源多克隆抗体；所述检测层上设置有检测带和质控带，所述检测带固定有抗蜜蜂丝状病毒囊膜蛋白的兔源多克隆抗体，所述质控带固定有蜜蜂丝状病毒囊膜蛋白；其中，蜜蜂丝状病毒囊膜蛋白的序列如序列表中序列2所示。


2.如权利要求1所述的检测试纸条，其特征在于，所述蜜蜂丝状病毒囊膜蛋白是将序列表中序列1所示的核苷酸片段插入到表达载体中表达后纯化得到所述蜜蜂丝状病毒囊膜蛋白；所述表达载体为PET-28a载体。


3.如权利要求1所述的检测试纸条，其特征在于，所述的支撑层为聚氯乙烯板；所述的加样垫为中速定性滤纸；所述的金标抗体释放垫为玻璃纤维素膜。


4.如权利要求1所述的检测试纸条，其特征在于，所述的检测层为硝酸纤维素膜。


5.如权利要求1所述的检测试纸条，其特征在于，所述的吸收层为玻璃纤维。


6.一种制备权利要求l-5任一项所述检测试纸条的方法，其包括如下步骤：
1）在检测层的不同位置上分别固定抗蜜蜂丝状病毒囊膜蛋白的兔源多克隆抗体以及蜜蜂丝状病毒囊膜蛋白，形成检测带和质控带；
2）制备金标抗体释放垫；
3）组装支撑层、加样垫、金标抗体释放垫、检测层和吸收层。


7.如权...

【专利技术属性】
技术研发人员：侯春生，邓炎春，杨大贺，杨卅，
申请(专利权)人：中国农业科学院蜜蜂研究所，
类型：发明
国别省市：北京;11