UMI-77作为线粒体自噬诱导剂在制备治疗炎症及神经退行性疾病药物中的应用制造技术

本发明专利技术公开了一种UMI‑77作为线粒体自噬诱导剂在制备治疗炎症及神经退行性疾病药物中的应用。本发明专利技术提出了MCL1抑制剂UMI‑77对线粒体自噬的诱导作用，通过对急性肝炎，炎症性肠病和APP/PS1小鼠模型中的效果来看，UMI‑77对炎症有显著的抑制效果，对阿尔兹海默症有显著缓解效果。

【技术实现步骤摘要】
UMI-77作为线粒体自噬诱导剂在制备治疗炎症及神经退行性疾病药物中的应用
本专利技术属于炎症治疗
，具体地说，涉及一种UMI-77作为线粒体自噬诱导剂在制备治疗炎症及神经退行性疾病药物中的应用。
技术介绍
线粒体自噬在炎症的抑制过程中发挥重要作用，而炎症是机体对抗感染的基本策略，同时也是导致疾病加重的主要原因，如某些神经退行性疾病，阿尔兹海默症。因此，筛选新的安全有效的线粒体自噬诱导剂是可能的抑制炎症，缓解疾病的治疗策略。现有的线粒体自噬诱导剂主要原理为破坏线粒体的功能，使细胞被迫发生线粒体自噬。虽然可以诱导线粒体自噬，但由于具有较大的毒性，并不能在临床应用中发挥作用。目前并没有发现MCL1抑制剂可以作为线粒体自噬诱导剂，也没有以线粒体自噬诱导剂或者MCL1蛋白抑制剂为靶点的药物治疗炎症和阿尔兹海默症。
技术实现思路
有鉴于此，本专利技术提供了一种UMI-77作为线粒体自噬诱导剂在制备治疗炎症和神经退行性疾病药物中的应用。为了解决上述技术问题，本专利技术公开了一种UMI-77作为线粒体自噬诱导剂在制备治疗炎症及神经退行性疾病药物中的应用。可选地，UMI-77诱导线粒体进入溶酶体发生线粒体自噬。可选地，炎症为急性肝炎或者炎症性肠病。可选地，神经退行性疾病为阿尔兹海默症。本专利技术还公开了一种人胚肾转化细胞HEK293Tmtkeima稳定细胞株，该细胞株于2019年3月7日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏号为：CCTCCNO:C201940。本专利技术还公开了一种人胚肾转化细胞HEK293Tmtkeima稳定细胞株的构建方法，包括以下步骤：1)慢病毒质粒准备：mtkeima序列合成后通过酶切连接方法，连入慢病毒质粒pCDH中形成pCDH-mtkeima，抽提无内毒素的质粒pCDH-mtkeima，慢病毒包装质粒pMD2.0G和psPAX2；2)慢病毒制备：HEK293T细胞以1*106个/ml密度种于15cm培养皿中，24小时后转染三个质粒pCDH-mtkeima，pMD2.0G和psPAX2，每个质粒10μg；分别在转染后48小时和72小时，收集上清，合并上清并用0.45μm滤膜过滤，以每30ml过滤上清加入7.5ml病毒浓缩溶液的比例，加入适量的浓缩溶液，混匀后，以每隔30分钟颠倒混匀3-5次，共进行4次；4℃放置过夜，第二天4000g，4℃离心20分钟，倒掉上清，用1mlPBS重悬病毒沉淀，-80℃保存；3)慢病毒感染：HEK293T细胞以5*105个/ml种于10cm培养皿中，24小时后，将制作好的慢病毒从-80℃中取出，充分溶解后滴入细胞培养物中，48小时后观察感染率，感染率大于90％评价为合格，向合格的感染细胞培养物中加入1μg/ml的嘌呤霉素清除未感染的细胞，2-3天后换液传代细胞，扩大培养，冻存细胞，得到人胚肾转化细胞HEK293Tmtkeima稳定细胞株。与现有技术相比，本专利技术可以获得包括以下技术效果：1)本专利技术通过建立线粒体自噬的高通量筛选模型，通过mtkeima蛋白的特性，可以方便的指征线粒体自噬；筛选到可以温和诱导线粒体自噬的诱导剂UMI-77；UMI-77为MCL1蛋白的特异性抑制剂。2)本专利技术MCL1抑制剂UMI-77对线粒体自噬的诱导作用，MCL1抑制剂UMI-77作为线粒体自噬诱导剂的新功能。同时MCL1抑制剂都可以作为线粒体自噬诱导剂的可能性。3)本专利技术UMI-77对与炎症的显著抑制效果；通过对急性肝炎和炎症性肠病小鼠模型中的效果来看，UMI-77对炎症有显著的抑制效果。4)本专利技术UMI-77对阿尔兹海默症的治疗效果显著；通过对APP/PS1小鼠模型中的效果来看，UMI-77对阿尔兹海默症有显著的改善效果。当然，实施本专利技术的任一产品并不一定需要同时达到以上所述的所有技术效果。附图说明此处所说明的附图用来提供对本专利技术的进一步理解，构成本专利技术的一部分，本专利技术的示意性实施例及其说明用于解释本专利技术，并不构成对本专利技术的不当限定。在附图中：图1是本专利技术验证人胚肾转化细胞HEK293Tmtkeima系统是否可以指征线粒体自噬；图2是本专利技术对2000多个FDA批准的药进行高通量筛选；颜色深浅代表586nm激发荧光与阴性对照对比的强弱；颜色越深代表线粒体自噬诱导越强；图3是本专利技术33个阳性药物二次验证，柱形图代表线粒体自噬诱导程度高低，越高代表诱导越强；实线是阴性对照基准线，虚线是1.5倍上升线；图4是本专利技术UMI-77诱导线粒体标记蛋白Tom20和Tim23降解；图5是本专利技术UMI-77处理细胞免疫杂交(westernblot)检测Caspase3的结果；图6是本专利技术人胚肾转化细胞HEK293Tmtkeima系统在UMI-77处理下诱导线粒体自噬结果；图像为biotekcytation3拍摄,放大倍数4X；红色(EM586对应的上下两幅图)为mtkeima586nm激发荧光，代表发生线粒体自噬的线粒体。绿色(EM469对应的上下两幅图)为488nm激发荧光代表正常线粒体；图7是本专利技术人胚肾转化细胞HEK293Tmtkeima细胞用UMI-77处理后活细胞拍摄激光共聚焦图片观察线粒体和溶酶体共定位；图8是本专利技术UMI-77处理HEK293T和Hela细胞导致的线粒体通过溶酶体发生降解；图9是本专利技术透射电子显微镜检测UMI-77处理HEK293T细胞后线粒体的结果；图10是本专利技术小鼠血液检测谷丙转氨酶和谷草转氨酶的活力测定结果，UMI-77抑制肝细胞破损；图11是本专利技术HE(苏木精-伊红)染色小鼠肝脏切片显示UMI-77恢复肝细胞正常形态；图12是本专利技术UMI-77诱导线粒体降解需要MCL1蛋白；图13是本专利技术InSituRedStarterKitMouse/Rabbit试剂盒(购自Sigma-Aldrich，#DUO92101)检测MCL1和LC3A相互作用；图14是本专利技术免疫共沉淀实验显示UMI-77诱导LC3A和MCL1相互作用增强；图15是本专利技术免疫共沉淀显示MCL1与LC3A相互作用通过LIRmotif实现；图16是本专利技术小鼠炎症性肠病模型及UMI77处理实验流程图；图17是本专利技术小鼠体重统计结果，在DSS诱导小鼠炎症性肠病模型中，UMI77可以显著性减缓体重下降幅度，提示其可以保护炎症性肠病；图18是本专利技术小鼠疾病活动指数统计结果，疾病活动指数基于体重变化、小鼠便血和粪便性状计算获得；图19是本专利技术小鼠结直肠代表性图，小鼠结直肠长度统计结果；图20是本专利技术小鼠结直肠HE染色图，小鼠结直肠组织病理评分；图21是本专利技术小鼠结直肠组织中炎症因子表达水平；图22是本专利技术定位巡航实验记录每组小鼠的逃避潜伏期；图23是本专利技术空间搜索实验记录小鼠穿过原平台的次数；图24是本专利技术空间搜索本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种UMI-77作为线粒体自噬诱导剂在制备治疗炎症及神经退行性疾病药物中的应用。/n

【技术特征摘要】
1.一种UMI-77作为线粒体自噬诱导剂在制备治疗炎症及神经退行性疾病药物中的应用。


2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，UMI-77诱导线粒体进入溶酶体发生线粒体自噬。


3.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，炎症为急性肝炎或者炎症性肠病。


4.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，神经退行性疾病为阿尔兹海默症。


5.一种人胚肾转化细胞HEK293Tmtkeima稳定细胞株，其特征在于，该细胞株于2019年3月7日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏号为：CCTCCNO:C201940。


6.一种人胚肾转化细胞HEK293Tmtkeima稳定细胞株的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：
1)慢病毒质粒准备：mtkeima序列合成后通过酶切连接方法，连入慢病毒质粒pCDH中形成pCDH-mtkeima，抽提无内毒素的质粒pCDH-mtkeima，慢病毒包装质粒p...

【专利技术属性】
技术研发人员：夏宏光，岑旭峰，许正平，盛静浩，徐晓燕，陈艳英，
申请(专利权)人：浙江大学，
类型：发明
国别省市：浙江;33