一种体外分离培养蒙古马睾丸精原干细胞的方法技术

本发明专利技术提供了一种体外分离培养蒙古马睾丸精原干细胞的方法，包括组织解离、组织消化、细胞纯化和细胞培养等步骤。本发明专利技术提供的方法可有效避免组织消化过程中产生的组织黏连和细胞基质聚集情况，保持细胞的活性和生物学功能；还可有效去除各种杂质细胞，得到高纯度的蒙古马睾丸精原干细胞；此外，本发明专利技术还对纯化后的蒙古马睾丸精原干细胞进行了高存活性和高增殖性的培养，保证蒙古马睾丸精原干细胞在体外的特征特性不发生改变。

【技术实现步骤摘要】
一种体外分离培养蒙古马睾丸精原干细胞的方法
本申请涉及生物
，尤其涉及一种体外分离培养蒙古马睾丸精原干细胞的方法。
技术介绍
精原干细胞(SpermatogoniaStemCells，SSCs)是位于曲精细管基膜上，既能自我更新维持自身适量恒定，又能定向分化产生精母细胞的一类原始精原细胞。由于雄性动物的生长发育，原始生殖细胞向生殖母细胞进行转变，并分化为精原干细胞。精子发生于睾丸的曲细精管中，精原干细胞位于曲细精管基膜底部，在朝向管腔一侧有支持细胞(Sertoli)覆盖，细胞大呈圆形或者卵圆形，细胞质中除核糖体外其余细胞器不发达。精原干细胞虽然不能和卵细胞授精，但它们会产生能够发育成精子的细胞。到了青春期，睾丸受脑垂体促性腺激素的刺激，精原干细胞开始启动，精原细胞不断增殖发育，演变成精子；精原细胞经过数次有丝分裂后，一部分成长为初级精母细胞，另一部分仍作为干细胞。初级精母细胞经过两次减数分裂最终形成两个精子细胞。有些学者发现在某些动物中存在着A型与B型精原细胞的中间型细胞，即In型精原细胞。A型精原细胞具有不含染色质的特点，根据其在曲细精本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种体外分离培养蒙古马睾丸精原干细胞的方法，其特征在于，包括如下步骤：/n(1)组织解离/n对采集的蒙古马睾丸组织样本进行消毒、脱囊、分离白膜和鞘膜、剪碎、除去血管；清洗后收集到离心管中反复进行重力沉淀，吸去上清，使用缓冲液清洗；对清洗后的样本进行吹打，使生精小管从组织中解离；/n(2)组织消化/n对解离的生精小管使用胶原酶IV消化20～30分钟；离心去上清后，使用透明质酸酶和脱氧核糖核酸酶I消化15～20分钟；离心去上清后，使用胰蛋白酶-EDTA和脱氧核糖核酸酶I消化5～10分钟；终止消化，重悬、细胞筛过滤，得到蒙古马睾丸单细胞悬液；/n(3)细胞纯化/n将蒙古马睾丸单细胞悬液接种于明胶...

【技术特征摘要】
1.一种体外分离培养蒙古马睾丸精原干细胞的方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1)组织解离
对采集的蒙古马睾丸组织样本进行消毒、脱囊、分离白膜和鞘膜、剪碎、除去血管；清洗后收集到离心管中反复进行重力沉淀，吸去上清，使用缓冲液清洗；对清洗后的样本进行吹打，使生精小管从组织中解离；
(2)组织消化
对解离的生精小管使用胶原酶IV消化20～30分钟；离心去上清后，使用透明质酸酶和脱氧核糖核酸酶I消化15～20分钟；离心去上清后，使用胰蛋白酶-EDTA和脱氧核糖核酸酶I消化5～10分钟；终止消化，重悬、细胞筛过滤，得到蒙古马睾丸单细胞悬液；
(3)细胞纯化
将蒙古马睾丸单细胞悬液接种于明胶包被的培养皿中，培养6～8小时；收集未贴附于明胶的细胞液，离心去上清后，接种于大鼠尾胶原I包被的培养皿中，培养4～5小时；收集未贴附于大鼠尾胶原I的细胞液，离心去上清后，接种于层粘连蛋白包被的培养板中，培养40～50分钟；收集贴附于层粘连蛋白上的细胞，即为纯化后的蒙古马睾丸精原干细胞；
(4)细胞培养
将纯化后的蒙古马睾丸精原干细胞接种于蒙古马睾丸支持细胞饲养层进行体外培养。


2.根据权利要求1所述的体外分离培养蒙古马睾丸精原干细胞的方法，其特征在于，所述组织解离的步骤在4℃环境中的冰上进行。


3.根据权利要求1所述的体外分离培养蒙古马睾丸精原干细胞的方法，其特征在于，所述组织解离的步骤中，进行重力沉淀的方法为：将所述离心管摇晃后置于冰上5～10分钟，弃上清；所述重力沉淀反复进行3～5次。

【专利技术属性】
技术研发人员：李蓓，宋连杰，杜明，崔迎迎，特日格乐，任秀娟，赵一萍，白东义，韩海格，芒来，张心壮，格日乐其木格，
申请(专利权)人：内蒙古农业大学，
类型：发明
国别省市：内蒙古;15