一种构建长QT综合征动物模型的多肽制造技术

本发明专利技术属于动物实验造模方法领域，涉及一种构建长QT综合征动物模型的多肽和动物实验用动物模型的建立方法，一种构建长QT综合征动物模型的多肽，该多肽的氨基酸序列为：GRKKRRQRRRGEVDEMIREADIDGDGQVNYEGFVQMM，命名为CM4。所述长QT综合征动物造模的方法为将多肽CM4给予动物，获得长QT综合征动物模型。本发明专利技术提供的模型建立方法简单可靠，方便科研人员建立长QT综合征小鼠或豚鼠离体心脏模型，并进行相关的实验研究。造模的过程简单有效，同时还可以设置相应的对照组，对比分析氨基酸突变前后心电图的变化。本发明专利技术通过给予CM4诱导小鼠和豚鼠离体心脏QT间期延长，CM4易于获得，纯度高，且可透过细胞膜进入细胞发挥作用，调节心肌钙通道的活性，造模效率高，成本低，方便进行相关实验的研究。

【技术实现步骤摘要】
一种构建长QT综合征动物模型的多肽
本专利技术属于动物实验造模方法领域，涉及一种构建长QT综合征动物模型的多肽和动物实验用动物模型的建立方法，特别涉及一种长QT综合征的动物造模。
技术介绍
长QT综合征(longQ-Tsyndrome，LQTS)，指心电图显示QT间期延长导致心室复极延迟，是猝死，晕厥发生的主要原因，然而心脏结构却没有明显异常，根据有无继发因素将其分为先天遗传性和后天获得性两大类。研究表明，Na+，K+，Ca2+离子通道或钙调蛋白(Calmodulin，CaM)的基因突变都会导致长QT综合征的发生。CaM通过与Ca2+结合被激活来调节心脏CaV1.2通道的开放和关闭，CaM发生基因突变以后可通过减弱CaV1.2通道Ca2+依赖性失活(CDI)而导致动作电位时程延长，心室复极化减弱，QT间期延长。目前CaM第141位氨基酸E141G是已发现的一种关键的错义突变体。它是第一个被发现的既影响CaV1.2钙通道的调节，又影响成年人NaV1.5钠通道调节的突变体。专利技术人设计了一种多肽来构建LQTS鼠模型。多肽药物是由氨基酸通过肽键连接，也是蛋白质的水解后的中间产物，其中寡肽是由2-10个氨基酸组成，多肽是由10-50个氨基酸组成。肽类药物具有活性高、疗效稳定、不良反应小、用量少等特点，在临床实践中被广泛应用。多肽药物能改善细胞氧化损伤，减轻组织炎症，抑制细胞内钙超载，降低心肌细胞凋亡率，抑制细胞自噬，抵抗心肌缺血再灌注损伤等。因此，越来越多的多肽被用于治疗疾病。然而，由于细胞膜天然屏障的作用，生物大分子在大量实际应用中受到限制，难以在细胞中发挥作用。针对上述问题，本领域研究人员通过利用穿膜肽来解决这个问题，穿膜肽是一种强细胞膜穿透的小分子肽，可携带多种大分子物质进入细胞。在1988年，Green和他的同事发现了TAT反式激活蛋白可以通过细胞膜单独进入细胞。1994年，Fawell等报道了TAT蛋白可以将外源性蛋白转入细胞，其发生转导作用的主要部分是TAT蛋白的第47～57个氨基酸，称为TAT蛋白转导结构，也称为细胞穿膜肽。它很快就被用于药物靶向给药的研究。在本专利技术的实施例中，利用细胞穿膜肽TAT蛋白(GenBank：AF525447，a.a.47-57，GRKKRRQRRRG)设计多肽，使其进入动物心肌细胞并发挥作用。本专利技术提供一种多肽，可穿透心肌细胞膜、具有延长QT间期作用且能稳定存在于动物体内，对研究钙调蛋白基因突变影响Cav1.2钙通道的机制具有重要作用。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种建立长QT综合征动物模型的方法，通过本专利技术提供的方法构建长QT综合征动物模型，通过给予本专利技术所述多肽CM4改变CaV1.2钙通道的调节作用，使得动作电位延长，心电图显示QT间期延长，实现相应的动物模型造模的目的。本专利技术构建长QT综合征动物模型为进一步研究其他钙调蛋白突变体或者离子通道突变所导致心血管系统疾病的机制奠定基础，在CaM突变体导致的长QT综合征的研究中提供帮助。为了实现上述目的，本专利技术提供了以下技术方案。一种构建长QT综合征动物模型的多肽，该多肽的氨基酸序列为：GRKKRRQRRRGEVDEMIREADIDGDGQVNYEGFVQMM，命名为CM4。所述构建长QT综合征动物模型的多肽，CM4多肽前11个氨基酸GRKKRRQRRRG是穿膜肽，能携带后面26个氨基酸穿透细胞膜，后26个氨基酸EVDEMIREADIDGDGQVNYEGFVQMM发挥作用的主体。所述构建长QT综合征动物模型的多肽来源于具致病作用的CaM突变体，用于制备CaM突变所导致的疾病模型。一种生物活性片段或衍生物，包含所述的多肽序列为核心序列，包括共价连接的化合物以及由核心序列组成的多聚体混合。一种多聚核苷酸序列，所述多聚核苷酸序列能编码CM4多肽序列以所述的多肽活性片段及其衍生物。所述构建长QT综合征动物模型的多肽，可穿透心肌细胞膜、具有延长QT间期作用且能稳定存在于动物体内。所述构建长QT综合征动物模型的多肽通过固相合成法制备。所述构建长QT综合征动物模型的多肽及所述的生物活性片段或衍生物在制备长QT综合征动物造模中的用途。进一步地，所述长QT综合征动物造模的方法为将多肽CM4给予动物，获得长QT综合征动物模型。所述动物为小鼠、豚鼠、大鼠、家兔及犬实验动物。所述给予CM4的方式是心脏体外灌流或腹腔注射、皮下注射及静脉注射。所述多肽CM4的剂型和剂量为任何药物治疗学上可接受的剂型和剂量。所述给予CM4的方式是心脏体外灌流或腹腔注射、皮下注射及静脉注射。所述心脏体外灌流CM4浓度10μM，腹腔注射CM4的量为21mg/kg。所述心脏体外灌流，是将CM4溶解于K-H液中进行的；所述腹腔注射，是将CM4溶解于生理盐水中进行的。心脏体外灌流包括以下步骤：采用Pulldown实验，在[Ca2+]为0、100nM、10μM和2mM条件下，检测CM4与心肌CaV1.2钙通道C末端的结合作用。所述建立长QT综合征动物模型的方法，具体包括以下步骤：步骤1、心脏主动脉原位插管：迅速分离摘除心脏并安装在Langendorff灌流装置上。平衡稳定15min，然后单独用K-H溶液或含CM4或含CM4-R的K-H溶液连续灌流60min。记录豚鼠离体心脏的心电图，统计QT(QTC)间期。利用Bazett公式(QTc[ms]＝QT[ms]/(RR[s])1/2)对QT间期进行校正。步骤2、小鼠给予多肽CM4三周后在体监测小鼠心电图，统计QT(QTC)间期。利用Bazett公式(QTc[ms]＝QT[ms]/(RR[s])1/2)对QT间期进行校正。实验开始之前，已向伦理委员会申请动物实验同意书，本专利技术的主要目的是造动物模型，在造动物模型的实验过程中涉及动物伦理，所以需要向伦理委员会申请同意书，为论理科学研究的基础先决条件保障。与现有技术相比，本专利技术的有益效果如下。(1)本专利技术提供的长QT综合征小鼠模型或豚鼠离体心脏模型是在动物培养过程中腹腔或心脏离体灌流给予CM4，实现心电图QT间期延长。本专利技术提供的模型建立方法简单可靠，方便科研人员建立长QT综合征小鼠或豚鼠离体心脏模型，并进行相关的实验研究。造模的过程简单有效，同时还可以设置相应的对照组，对比分析氨基酸突变前后心电图的变化。本专利技术通过给予CM4诱导小鼠和豚鼠离体心脏QT间期延长，CM4易于获得，纯度高，且可透过细胞膜进入细胞发挥作用，调节心肌钙通道的活性，具有造模效率高，成本低，方便进行相关实验的研究。(2)本专利技术的动物模型建立方法克服了现有技术的成本昂贵、耗时长的缺点，具有可控性，操作简单，成本低，快速的提供大量的适合相关研究的应用的动物模型。(3)本专利技术的动物模型的建立方法的研究方式属于完全创新型研究，和目前国内外的转基因小鼠相比，具有可控性，操作简单，成本低，快速的提供大量的适合相关研究的应用的动物本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种构建长QT综合征动物模型的多肽，其特征在于， 该多肽的氨基酸序列为：/nGRKKRRQRRRGEVDEMIREADIDGDGQVNYEGFVQMM，命名为CM4。/n

【技术特征摘要】
1.一种构建长QT综合征动物模型的多肽，其特征在于，该多肽的氨基酸序列为：
GRKKRRQRRRGEVDEMIREADIDGDGQVNYEGFVQMM，命名为CM4。


2.如权利要求1所述的一种构建长QT综合征动物模型的多肽，其特征在于，多肽CM4前
11个氨基酸GRKKRRQRRRG是穿膜肽，能携带后面26个氨基酸穿透细胞膜，后26个氨基酸EVDEMIREADIDGDGQVNYEGFVQMM发挥作用的主体。


3.如权利2所述的一种构建长QT综合征动物模型的多肽，其特征在于，该多肽来源于具致病作用的CaM突变体，用于制备CaM突变所导致的疾病模型。


4.一种生物活性片段或衍生物，其特征在于，包含权利要求1所述的多肽序列为核心序列，包括共价连接的化合物以及由核心序列组成的多聚体混合。


5.一种多聚核苷酸序列，其特征在于，所述多聚核苷酸序列能编码CM4多肽序列以及权利要求4所述的多肽活性片段及其衍生物...

【专利技术属性】
技术研发人员：郝丽英，苏敬阳，
申请(专利权)人：中国医科大学，
类型：发明
国别省市：辽宁;21