本发明专利技术公开了一种Tth DNA聚合酶融合蛋白及其合成方法，属于分子生物学技术领域，Tth DNA聚合酶的氨基末端引入古细菌的Sso7d的DNA，在构建融合蛋白的同时在Tth DNA聚合酶羧基末端引入6个组氨酸的亲和标签，采用镍亲和柱进行纯化，将Tth DNA聚合酶与古细菌的Sso7dDNA结合功能域进行融合表达，得到PCR扩增效率和活性更高的融合蛋白，Sso7d片段融合在Tth DNA聚合酶融合在氨基末端。本发明专利技术能得到了效率和活性更高的融合蛋白，Sso7d片段融合在Tth DNA聚合酶氨基基末端，简化酶的纯化，纯化工艺通过镍亲和柱即可实现，用于DNA扩增和RNA的逆转录扩增显示出更高的效率。
【技术实现步骤摘要】
一种TthDNA聚合酶融合蛋白及其合成方法
本专利技术涉及一种融合蛋白及其合成方法，特别是涉及一种TthDNA聚合酶融合蛋白及其合成方法，属于分子生物学
技术介绍
TthDNA聚合酶具有逆转录和PCR扩增双重功能的DNA多聚酶，可以用于PCR和一步法RT-PCR，特别是后者，是直接从RNA为模板直接扩增片段常用的一种工具酶，古细菌的Sso7d的DNA结合功能域在分子生物学的工具酶上，也得到较为广泛的应用，如与Taq和PfuDNA多聚酶进行融合表达，可使得酶的扩增速度增加几倍，显著性得提高酶效率，TthDNA聚合酶是一步法RT-PCR扩增中关键酶，活性高低是试验是否成功的关键因素，为增强TthDNA聚合酶的效率，我们将古细菌的Sso7d的DNA结合功能域和TthDNA聚合酶融合表达，得到活性更高的聚合酶，有利于高效率进行RT-PCR扩增。
技术实现思路
本专利技术的主要目的是为了提供一种TthDNA聚合酶融合蛋白及其合成方法，聚合酶活性更高，更适合于高效率一步法RT-PCR的扩增。本专利技术的目的可以通过采用如下技术方案达到：一种TthDNA聚合酶融合蛋白，TthDNA聚合酶的氨基末端引入古细菌的Sso7d的DNA，在构建融合蛋白的同时在TthDNA聚合酶羧基末端引入6个组氨酸的亲和标签，采用镍亲和柱进行纯化。优选的，将TthDNA聚合酶与古细菌的Sso7dDNA结合功能域进行融合表达，得到PCR扩增效率和活性更高的融合蛋白。优选的，Sso7d片段融合在TthDNA聚合酶融合在氨基末端。优选的，Sso7d蛋白序列为：优选的，TthDNA聚合酶蛋白序列为：优选的，TthDNA聚合酶蛋白序列为：一种TthDNA聚合酶融合蛋白合成方法，包括如下步骤：步骤1：TthDNA聚合酶的氨基末端引入古细菌的Sso7d的DNA，在构建融合蛋白的同时在TthDNA聚合酶羧基末端引入6个组氨酸的亲和标签，用镍亲和柱进行纯化；步骤2：将TthDNA聚合酶和古细菌的Sso7dDNA结合功能域进行融合表达，得到了PCR扩增效率和活性更高的融合蛋白；步骤3：将Sso7d片段融合在TthDNA聚合酶融合在氨基末端；步骤4：得到TthDNA聚合酶蛋白。进一步的，Sso7d蛋白序列为：进一步的，TthDNA聚合酶蛋白序列为：进一步的，TthDNA聚合酶蛋白序列为：本专利技术的有益技术效果：本专利技术提供的TthDNA聚合酶融合蛋白，是一种TthDNA聚合酶融合蛋白，是将古细菌的Sso7d的DNA结合功能域和TthDNA聚合酶进行融合表达，融合基团设计在氨基末端，在TthDNA聚合酶羧基末端引入6个组氨酸标签，预期得到的重组蛋白具有更高的扩增效率，同时因在重组的融合蛋白氨基末端引入6个组氨酸标签，简化了酶的纯化方法，纯化工艺通过镍亲和柱即可实现，新的酶在一步法RT-PCR扩增中，具有更高的效率。附图说明图1为按照本专利技术的TthDNA聚合酶融合蛋白的新酶扩增效率示意图。图中：1为DNA分子量标准，2为2单位TthDNAPolymerase扩增的条带，3为2单位Ssod7-TthDNApolumerase扩增的条带。具体实施方式为使本领域技术人员更加清楚和明确本专利技术的技术方案，下面结合实施例及附图对本专利技术作进一步详细的描述，但本专利技术的实施方式不限于此。实施例1：本实施例1提供的TthDNA聚合酶融合蛋白，其TthDNA聚合酶氨基末端引入古细菌的Sso7d的DNA，在构建融合蛋白的同时在TthDNA聚合酶羧基末端引入6个组氨酸的亲和标签，用镍亲和柱进行纯化。将所述TthDNA聚合酶和古细菌的所述Sso7dDNA结合功能域进行融合表达，得到了效率和活性更高的融合蛋白，更加适合于一步RT-PCR扩增。将所述Sso7d片段融合在所述TthDNA聚合酶氨基末端，6个组氨酸标签融合在羧基末端。该实施例1是一种TthDNA聚合酶融合蛋白，首先将Sso7d-TthDNA聚合酶融合蛋白序列优化的核苷酸序列引入NcoI和XhoI位点序列，该人工合成序列，通过基因合成获得。克隆的载体选用pET28a,构建的表达载体转入BL21(DE3)进行表达；表达的融合蛋白，破菌后，上清蛋白在75℃处理30分钟，冰上30分钟，离心收集上清，用NTA-琼脂糖凝胶吸附，咪唑解离，得到酶纯度为95％的酶液，酶液在10mMTrisHClpH7.5,300mMKCl,1mMDTT,0.1mMEDTA,0.1％TritonX-100,50％甘油透析3次，-20℃保存。其中作为本实施例中的Sso7d蛋白序列为：TthDNA聚合酶蛋白序列为：TthDNA聚合酶融合蛋白序列为：本实施例是一种TthDNA聚合酶融合蛋白，是将古细菌的Sso7d的DNA结合功能域和TthDNA聚合酶进行融合表达，融合基团设计在氨基末端，在TthDNA聚合酶的羧基末端引入6个组氨酸标签。预期得到的重组蛋白具有更高的扩增效率，同时因在重组的融合蛋白羧基末端引入6个组氨酸标签，简化了酶的纯化方法，纯化工艺通过镍亲合柱结合即可实现，新的酶分子用于一步法RT-PCR扩增，显示出更高的效率。为验证新酶的扩增效率，我们采用培养的Hela细胞，用Trizol提取总RNA,取1微克总RNA用Oligo-dT作为逆转录引物，然后用引物正向引物5’-atgggcgacaaagggacgcgagtgt-3’和反向引物cgccgccccgagactccaccagct进行PCR扩增人beta-arrestin的cDNA。在20微升50mMBiscine/KOH,pH8.2,115mMKAc,2.5mMMnAc2,8％甘油体系中缓冲液里进行逆转录，里面含有1微克的上述的总RNA,200单位RNaseAinhibitor，0.3mMdNTP，Oligo-dT0.5微克和2单位酶。先在65℃反应30分钟，再进行PCR反应，PCR的反应条件为，94℃先变性1分钟，再在94℃，60℃，72℃，三个温度下循环反应30个循环，最后在72℃延伸10分钟，电泳结束后，用琼脂糖电泳分析目的条带。结果表明，如图1所示，用新酶和没有添加Sso7d功能域的TthDNAPOLYMERASE进行比较，新酶扩增效率显著高于没有添加Sso7d功能域TthDNAPOLYMERASE。综上所述，在本实施例中，本实施例提供的TthDNA聚合酶融合蛋白，是一种TthDNA聚合酶融合蛋白，是将古细菌的Sso7d的DNA结合功能域和TthDNA聚合酶进行融合表达，融合基团设计在氨基末端，在TthDNA聚合酶羧基末端引入6个组氨酸标签，预期得到的重组蛋白具有更高的扩增效率，同时因在重组的融合蛋白氨基本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种Tth DNA聚合酶融合蛋白，其特征在于，Tth DNA聚合酶的氨基末端引入古细菌的Sso7d的DNA，在构建融合蛋白的同时在Tth DNA聚合酶羧基末端引入6个组氨酸的亲和标签，采用镍亲和柱进行纯化。/n
【技术特征摘要】
1.一种TthDNA聚合酶融合蛋白，其特征在于，TthDNA聚合酶的氨基末端引入古细菌的Sso7d的DNA，在构建融合蛋白的同时在TthDNA聚合酶羧基末端引入6个组氨酸的亲和标签，采用镍亲和柱进行纯化。
2.如权利要求1所述的一种TthDNA聚合酶融合蛋白，其特征在于，将TthDNA聚合酶与古细菌的Sso7dDNA结合功能域进行融合表达，得到PCR扩增效率和活性更高的融合蛋白。
3.如权利要求1所述的一种TthDNA聚合酶融合蛋白，其特征在于，Sso7d片段融合在TthDNA聚合酶融合在氨基末端。
4.如权利要求1所述的一种TthDNA聚合酶融合蛋白，其特征在于，Sso7d蛋白序列为：
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5.如权利要求1所述的一种TthDNA聚合酶融合蛋白，其特征在于，TthDNA聚合酶蛋白序列为：
6.如权利要求1所述的一种TthDNA聚合酶融合蛋白，其特征在于，TthDNA聚合酶蛋白序列为：
【专利技术属性】
技术研发人员：郁庆明，
申请(专利权)人：南京瓦尔生物医药有限公司，
类型：发明
国别省市：江苏;32
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