本发明专利技术涉及化学发光免疫分析检测领域内一种基于单金属Cu‑MOF模拟酶的多组分无标记的免疫传感器，用壳聚糖将单金属Cu‑MOF模拟酶固定于环氧硅烷化微孔阵列界面，然后在Cu‑MOF模拟酶传感界面修饰链霉亲和素，最后通过链霉亲和素对生物抗体的特异结合，将不同组分的捕获抗体分子分别固定于微孔阵列界面制得该多组分无标记化学发光成像免疫传感器。本发明专利技术中，抗原抗体特异性反应所形成的免疫复合物会阻碍单金属Cu‑MOF模拟酶对化学发光底物的催化作用，从而导致化学发光成像信号强度的减弱，实现了对多种抗原的无标记高通量检测。再通过在传感器界面上温育相对应的抗原，实现对多组分抗源的同时检测，具有分析通量高，分析成本低，灵敏度和准确性高等其他优势。
【技术实现步骤摘要】
一种基于单金属Cu-MOF模拟酶的多组分无标记的免疫传感器
本专利技术涉及化学发光分析、多组分免疫分析、肿瘤标志物联合检测等领域，具体涉及了一种基于单金属Cu-MOF模拟酶的多组分无标记的免疫传感器。
技术介绍
化学发光免疫分析是将高灵敏度的化学发光和高特异性的免疫测定结合而建立起的分析方法（chemiluminescenceimmunoassay，CLIA）。多组分免疫分析法（multianalyteimmunoassay,MIA）是指用一次分析流程可同时检测两种及以上分析对象的免疫方法，其具有样品通量高、分析时间短和成本低等优势。针对生命科学、临床医学、食品安全等领域常常要求测定多种分析对象含量的需求，将化学发光免疫分析与多组分免疫分析结合起来进行同时检测的想法日益受到关注。传统的多组分化学发光免疫分析常采用标记型方法，需要预先对多种抗体或抗原进行标记，存在着最优条件无法统一、标记步骤复杂、高速冷冻离心过程中对生物分子及标记物造成影响、标记，分离及多次洗涤过程易使抗体或抗原分子的活性降低甚至失活等问题。因此，近几年来，发展多组分无标记型化学发光免疫分析受到了研究者的广泛关注，无需预先标记，并且具有分析快速，操作简便，耗材量少等显著优势，能够实现有效的痕量分析。传统的多组分化学发光免疫分析中常以辣根过氧化物酶（HRP）作为标记物来催化鲁米诺-过氧化氢体系发光从而实现高灵敏检测。但天然酶因稳定性差、提取困难、来源有限等缺点制约了它的生产应用。因此，将具有过氧化物酶活性的纳米材料代替天然酶或与天然酶复合后应用于化学发光免疫测定中成为研究热潮。自Manea的研究小组提出了“纳米酶”的概念，这些具有内源性过氧化物酶活性的纳米酶得到了快速发展。其中由金属离子和有机连接物自组装形成的金属有机骨架（MOF）因其具有比表面积大、孔隙率高、稳定性好等特点而受到人们的特别关注。笔者研究发现MOF表现出过氧化物酶样活性，已被用于过氧化氢和抗坏血酸的比色检测。虽然金属MOF的过氧化物酶样活性得到了广泛的研究，但是主要被应用于比色检应用领域，在化学发光免疫分析领域还未见报道。因此本专利技术以三水合硝酸铜为原料，对苯三甲酸为配体，合成八面体形状的Cu-MOF模拟酶，将其引入到化学发光成像免疫分析领域，大大改善了天然酶固有的缺陷，制备了一种基于单金属Cu-MOF模拟酶的多组分无标记化学发光成像免疫传感器，实现对多种目标抗原的高通量、同时无标记检测。
技术实现思路
本专利技术针对现有技术中多组份化学发光免疫分析中天然酶的缺点，提供一种利用单金属框架Cu-MOF模拟酶的多组分无标记化学发光成像免疫传感器，实现对多种目标抗源的高通量、无标记化的检测。本专利技术的目的是这样实现的，一种基于单金属Cu-MOF模拟酶的多组分无标记的免疫传感器，用壳聚糖将单金属框架Cu-MOF模拟酶固定于环氧硅烷化微孔阵列界面，然后在Cu-MOF模拟酶传感界面修饰链霉亲和素，最后通过链霉亲和素对生物抗体的特异结合，将多种捕获抗体分子分别固定于微孔阵列界面制得该多组分无标记化学发光成像免疫传感器。本专利技术的免疫传感器，在环氧硅烷化载玻片表面成功构建化学发光阵列免疫传感界面，该界面依次包括环氧硅烷化免疫微孔作为基底连接层；Cu-MOF模拟酶-壳聚糖层作为化学发光信号层；链霉亲和素层作为抗体连接层；多组分生物素化抗体层作为免疫反应识别层。利用亲和素-生物素的特异性识别固定不同的生物素化抗体；再利用牛血清白蛋白封闭液来封闭非特异性识别位点后制备多组分无标记化学发光成像免疫阵列传感器。也就是通过在传感器界面上修饰相对应的多组分抗原样品，最后滴入化学发光底物。抗原抗体特异性反应所形成的免疫复合物会阻碍单金属Cu-MOF模拟酶对化学发光底物的催化作用，从而导致化学发光成像信号强度的减弱，实现了对多种抗原的无标记高通量检测。再通过在传感器界面上温育相对应的抗原，利用电感耦合CCD实现对多组分肿抗源同时检测，具有分析通量高，分析成本低，灵敏度高等其他优势，并且能提高肿瘤临床诊断的准确性。与标记型免疫分析相比，无标记型免疫分析传感器能够直接测定生物标志物，在测定过程中也无需预先对抗体或抗原进行标记，此种无标记型免疫分析传感器检测耗时短，成本低且操作简单高效，能适应直接、实时、原位、在线的痕量免疫分析。进一步地，所述免疫传感器通过如下方法制备：a：利用丝网印刷工艺借助于4排12列的定制模板在可抛式环氧基硅烷化载玻片上印刷多排多列排布的若干个微孔阵列，所述微孔孔径为2mm，孔距及边心距离均为4mm；本步制得的具有疏水性无光活性的免疫微孔阵列，为多组分同时检测提供足够有效的位置；b：制备八面体形状的单金属框架Cu-MOF模拟酶纳米粒子；c：将b步制得的单金属框架Cu-MOF模拟酶纳米粒子在去离子水中超声分散，分散浓度为3-5mg/mL，再与质量浓度为1.0-1.5%的壳聚糖溶液等体积混合，震荡均匀后滴入a步的微孔阵列的微孔表面，在室温下反应直至晾干，以形成一层Cu-MOF-壳聚糖的薄膜；本步中，利用壳聚糖的生物相容性使单金属框架Cu-MOF包埋固定在基底层；d：将链霉亲和素均匀滴加在c步的Cu-MOF-壳聚糖薄膜表面，置于4℃环境中晾干；e：向d步得到的微孔阵列表面分行或分列分别滴加不同组分的生物素化抗体，使其与链霉亲和素功能化的微孔表面进行特异性结合，于4℃环境中密封温育3-4小时，然后用磷酸盐缓冲溶液冲洗掉多余的抗体并于氮气下吹干；本步中使用了亲和素—生物素固定法，根据链霉亲和素的结构可知：一分子的链霉亲和素能与四分子的生物素相结合，两者之间的亲和力极其强烈，首先链霉亲和素可以通过静电吸附固定在免疫微孔的表面上，随后利用生物素—亲和素的特异性识别作用高效地连接抗体，因此这种固定法不仅能起到固定作用，还可以放大信号，提高检测的灵敏度；f：将牛血清白蛋白封闭液均匀滴加在e步得到的界面，放置4℃环境中进行封闭，而后用磷酸盐缓冲溶液冲洗并于氮气下吹干，即可得到多组分无标记化学发光成像免疫分析传感器。进一步地，所述可抛式环氧基硅烷化载玻片通过如下方法制得：a1：将可抛式载玻片浸泡于水虎鱼酸溶液中8~12h，然后用去离子水冲洗干净后放置于室温下晾干，所述水虎鱼酸溶液由体积比为7:3的98%硫酸和过氧化氢的混合液；a2：将上述处理后的载玻片浸泡于质量浓度为1%的GPTMS甲苯溶液中10-16h，先用甲苯冲洗后再用无水乙醇冲洗，然后于室温下晾干或用氮气吹干。更进一步地，上述传感器制备方法的b步中，单金属框架Cu-MOF模拟酶通过如下方法制备：b1将三水合硝酸铜、聚乙烯吡咯烷酮K30加入到甲醇溶液中，搅拌形成溶液A，其中溶液A中三水合硝酸铜、聚乙烯吡咯烷酮K30的浓度分别为0.075mol/L和0.00016mol/L；b2:将1,3,5-苯三羧酸溶于甲醇溶液中，搅拌形成浓度为0.04~0.05mol/L的溶液B；b3:将溶溶液B缓慢加入等体积的溶液A中，继续搅拌混合均匀，室温下静置24h以上；...
【技术保护点】
1.一种基于单金属Cu-MOF模拟酶的多组分无标记的免疫传感器，其特征在于，用壳聚糖将单金属框架Cu-MOF模拟酶固定于环氧硅烷化微孔阵列界面，然后在Cu-MOF模拟酶传感界面修饰链霉亲和素，最后通过链霉亲和素对生物抗体的特异结合，将不同组分的捕获抗体分子分别分行或分列固定于微孔阵列界面制得该多组分无标记化学发光成像免疫传感器。/n
【技术特征摘要】
1.一种基于单金属Cu-MOF模拟酶的多组分无标记的免疫传感器，其特征在于，用壳聚糖将单金属框架Cu-MOF模拟酶固定于环氧硅烷化微孔阵列界面，然后在Cu-MOF模拟酶传感界面修饰链霉亲和素，最后通过链霉亲和素对生物抗体的特异结合，将不同组分的捕获抗体分子分别分行或分列固定于微孔阵列界面制得该多组分无标记化学发光成像免疫传感器。
2.根据权利要求1所述的基于单金属Cu-MOF模拟酶的多组分无标记的免疫传感器，其特征在于，所述免疫传感器通过如下方法制备：
a：利用丝网印刷工艺借助于定制模板在可抛式环氧基硅烷化载玻片上印刷多排多列排布的若干个微孔阵列，所述微孔孔径为2mm，孔距及边心距离均为4mm；
b：制备八面体形状的单金属框架Cu-MOF模拟酶纳米粒子；
c：将b步制得的单金属框架Cu-MOF模拟酶纳米粒子在去离子水中超声分散，分散浓度为3-5mg/mL，再与质量浓度为1.0-1.5%的壳聚糖溶液等体积混合，震荡均匀后滴入a步的微孔阵列的微孔表面，在室温下反应直至晾干，以形成一层Cu-MOF-壳聚糖的薄膜；
d：将链霉亲和素均匀滴加在c步的Cu-MOF-壳聚糖薄膜表面，置于4℃环境中晾干；
e：向d步得到的微孔阵列表面分行或分列分别滴加同组分或不同组分的生物素化抗体，使其与链霉亲和素功能化的微孔表面进行特异性结合，于4℃环境中密封温育3-4小时，然后用磷酸盐缓冲溶液冲洗掉多余的抗体并于氮气下吹干；
f：将牛血清蛋白封闭液均匀滴加在e步得到的界面，放置4℃环境中进行封闭，而后用磷酸盐缓冲溶液冲洗并于氮气下吹干，即可得到多组分无标记化学发光成像免疫分析传感器。
3.根据权利要求1所述的基于单金属Cu-MOF模拟酶的多组分无标记化学发光成像免疫传感器，其特征在于，所述可抛式环氧基硅烷化载玻片通过如下方法制得：
a1：将可抛式载玻片浸泡于水虎鱼酸溶液中8~12h，然后用去离子水冲洗干...
【专利技术属性】
技术研发人员：杨占军，陆欣，李娟，
申请(专利权)人：扬州大学，
类型：发明
国别省市：江苏;32
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