一种检测血清(浆)叶酸浓度的试剂盒制造技术

本发明专利技术属于试剂装置的技术领域，特别是涉及一种检测血清（浆）叶酸浓度的试剂盒，其是根据干酪乳酸菌青霉素耐药株（ＡＴＣＣ７４６９）生长需要叶酸作为其必需营养物质的原理设计的检测方法，并将测试所需的必要试剂经合理搭配组装成盒，方便使用，其叶酸标准系列溶液的浓度分别为０、４、８、１２、１６、２０微克／升，被检样品无需预先稀释，直接加样５微升即可测定，在盒体内设有培养基瓶、叶酸标准液瓶、干酪乳酸菌液瓶、防腐剂液体瓶。该试剂是一种基于９６孔微量反应板并应用免疫酶联测定仪比浊测定进行定量测定的叶酸检测方法，该方法检测叶酸成本低廉、操作简便，适合妇幼机构大范围开展叶酸营养筛查。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及临床体外诊断试剂应用
，特别是涉及一种定量检 测血清(浆)中叶酸浓度的试剂盒。
技术介绍
目前测定血清(浆)叶酸浓度的的商品试剂盒均以化学发光免疫和放 射免疫法为基本原理，价格较高，而且测定结果不能完全反映具有生物学 活性的叶酸成份。在医学领域应用，不仅增加患者经济负担，而且容易使 医生对患者的叶酸营养状况作出错误的判断。《卫生研究》第32巻，第1期，56， 2003年1月，皇甫照；王毓明；郑家驹."96 孔板微生物法微量测定血浆和红细胞内叶酸含量"其使用的材料叶酸培养基、 叶酸标准品、干酪乳酸杆菌、丙三醇、96子L细胞培养板、免疫酶联测定仪；测定方法-准备样品分离血清，-20°保存直到测定。准备检测用的微生物Lcasei (NCIB10463)， 微孔板测定步骤用新配制的0.5%抗坏血酸钠溶液稀释血清(按1: 20)和红细胞(按1: 40)。 混匀，加入4个孔(2个孔分别加IOO微升、另两孔分别加50微升)用50 微升0.5%抗坏血酸钠将所有的孔补偿至100微升。稀释的红细胞溶解液。测定标准品叶酸标准溶液(500pg/ml)是用0.5%抗坏血酸钠稀释的。 加入这种标准品使每个孔叶酸含量范围在0至50pg(0-100微升)，所有孔的 液体体积用0.5抗坏血酸钠补足至100微升。培养基:蒸馏水中加入5.7克叶酸培养基干粉、3毫克氯霉素、30微升吐温 -80，配成100毫升培养基。混匀后，加热至沸，冷却后，每百毫升培养基 加入75毫克抗坏血酸。最后，加入上述的检测用微生物。边搅拌边向微孔 板的每个微孔中加入200微升培养基。额外做一个加入了异丙醇消毒剂(1: 25)的微孔作为检测时的空白对照孔。所有的微孔板用封口膜封紧后，颠 倒混匀，在暗处37°孵育42小时。然后充分颠倒混匀，揭去封口膜，使用 570nm波长检测。方法使用氯霉素耐药株(NCIB10463)避免了无菌操作 节省了时间。封闭了微孔板使混合操作变得容易。评价测试方法的性能包 括叶酸回收率、测定的重复性和对叶酸浓度的剂量反应。获得的193个血 清、150个红细胞叶酸结果与传统的微生物方法对比。结果回收率很好， 血清叶酸的批间和批内精密度均小于5%，红细胞叶酸也小于5%。等摩尔 测定反应采用叶酸、5-甲基四氢叶酸和5-甲酰四氢叶酸。微量测定与传统的方法相关良好，相关系数分别为0.975 (血清)和0.96 (红细胞)。结论:该法比传统方法更紧凑、耗时更少。尤其对临床常规实验室更经济和更易 操作。但是现有的微孔板微生物培养法测定血清叶酸的操作方法，标准溶 液浓度较低，培养基浓度较高，因此在临床诊断中应用需要将血清预先稀 释，操作较繁琐。
技术实现思路
本专利技术的目的是解决现有技术的96孔板微生物法微量测定血浆和红细 胞内叶酸含量试剂存在的问题，提供一种成本低廉、操作简便，适合妇幼 机构大范围开展叶酸营养筛査的检测血清(浆)叶酸浓度的试剂盒方便使 用。为达到本专利技术的目的根据耐受青霉素的干酪乳酸菌生长需要叶酸作为 其必需营养物质的原理设计的检测方法，并将测试所需的必要试剂经合理 搭配组装成盒，该试剂是一种基于96孔微量反应板并应用免疫酶联测定仪 比浊测定进行定量测定的叶酸检测方法。提供一种检测血清(浆)叶酸浓度的试剂盒，包括检测血清(浆)叶酸浓度的试剂瓶及放置试剂瓶的盒盖5、盒底6，其特征在于，该试剂盒内含有6个叶酸标准品的浓度分别为 0微克/升、4微克/升、8微克/升、12微克/升、16微克/升、20微克/升， 每个标准品溶液均含0. 5%抗坏血酸钠的叶酸标准品瓶1; 2个每百毫升水溶 液含有叶酸酪蛋白培养基干粉4. 7的克叶酸培养基瓶4; 1个含40%甘油的 干酪乳酸菌溶液瓶2; 1个浓度为3%的叠氮钠水溶液瓶3、数个微孔板封口所述的检测血清(浆)叶酸浓度的试剂盒，其特征是检测血清(浆) 叶酸浓度的试剂盒使用方法是 试剂组成g、培养基溶液 15mlX2 m、叶酸标准溶液<table>table see original document page 5</column></row><table>n、微孔板封口膜 2张 z、 3%叠氮钠溶液 lmly、干酪乳酸菌溶液 lml 实验材料-微孔容量至少300微升的96孔细胞培养板，并且内壁洁净能够用于组 织细胞培养；免疫酶联测定仪；微孔容量至少30微量？加样器要求能够准确加样5微升；与微量加 样器相匹配的吸头要求一次性使用，不可复用； 标本收集和保存叶酸对光敏感，标本采集和保存过程中尽量减少光暴露。推荐测定血清叶酸，不要使用EDTA抗凝血浆，血清标本室温保存不宜超过8小时；8 小时内如不能测定，需盖紧盖子并置2-8'C冰箱保存标本；如48小时内不 能完成测定，则需将血清标本冷冻于-20。C以下；标本只能冻融一次，融化 后需充分混匀；冰冻标本可在无霜冷柜保存30天；如需保存30天以上， 则需冷冻于-8CTC以下；测定前请确认标本无纤维蛋白或其它颗粒物质，无气泡； 测定步骤1) 在室温下融化实验所需试剂；2) 每15ml培养基加干酪乳酸菌溶液90"l，混匀备用；3) 在微孔板中分别加入各浓度叶酸标准液5ul，空白孔加标准液"A" 5 yl，样品孔加待检血清5ul;4) 在空白孔内加入5ul叠氮钠溶液；5) 所有检测孔中加入280ul已混合干酪乳酸菌溶液的培养基；6) 用封口胶严密封堵微孔板各孔，不可留有缝隙；7)置37"C环境孵育18小时后，充分混匀，撕下封口胶，静置30秒， 确认各孔内无气泡后，于免疫酶联测定仪580-620nm比浊测定；选择适当 的标准曲线拟合方式计算待检血清(浆)的叶酸浓度；如果待检样品的叶 酸浓度超过标准曲线范围，需要将待检样品用标准溶液"A"适当稀释后重 新测定，结果乘以样品的稀释倍数。现有的微孔板微生物培养法测定血清叶酸的操作方法，标准溶液浓度 较低，培养基浓度较高，因此需要将血清预先稀释，操作较繁琐。本专利技术 将叶酸标准液的浓度设定为0微克/升、4微克/升、8微克/升、12微克/ 升、16微克/升、20微克/升，同时将"叶酸酪蛋白培养基"浓度降低至4. 7%， 将样本加入量设定为5微升，将加培养基加入量设定为250至300微升。这样无需预先稀释血清(浆)样本，而可直接加样测试，简化了步骤，易 于操作。本专利技术的有益效果是，解决了以往微生物法测定血清叶酸过程中需要 预先稀释血清(浆)再行检测的繁琐过程、同时縮短了检测时间。本试剂 盒的研制，填补了国内微生物法检测叶酸浓度的商品化体外诊断试剂的空 白，该试剂盒成本低廉，有望在相关人群的叶酸营养评价中大规模应用。 本试剂盒所使用的方法是根据干酪乳酸菌青霉素耐药株的生长需要叶酸作 为营养物质，在一定时间内干酪乳酸菌生长的多少与被检物叶酸含量呈一 定函数关系的原理测定叶酸浓度的。该法应用至今己有五十多年，具有很 高的灵敏度和准确度、成本低、能反映具有生物活性的叶酸含量等优点， 但也存在操作繁琐、试剂消耗量大等缺点，因而至今没有基于这种检测原 理的商品化试剂盒供医院、科研院所等单位使用。 附图说明图l为本专利技术的检测血清(浆)叶酸浓度的试剂盒结构示意图； 附图符号说明1:叶酸本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种检测血清（浆）叶酸浓度的试剂盒，包括：检测血清（浆）叶酸浓度的试剂瓶及放置试剂瓶的盒盖５、盒底６，其特征在于，该试剂盒内含有６个叶酸标准品的浓度分别为０微克／升、４微克／升、８微克／升、１２微克／升、１６微克／升、２０微克／升，每个标准品溶液均含０．５％抗坏血酸钠的叶酸标准品瓶１；２个每百毫升水溶液含有叶酸酪蛋白培养基干粉４．７的克叶酸培养基瓶４；１个含４０％甘油的干酪乳酸菌溶液瓶２；１个浓度为３％的叠氮钠水溶液瓶３、数个微孔板封口膜７。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：叶涛，
申请(专利权)人：叶涛，
类型：发明
国别省市：12[中国|天津]