一种基因编辑工具及其制备方法与多轮基因编辑的方法技术

一种基因编辑工具及其制备方法与多轮基因编辑的方法，属于基因工程技术领域。针对现有多轮基因编辑方法费时费力的问题，本发明专利技术提供了一种基因编辑工具，包括如下三种sgRNA表达母质粒：pRock系列母质粒、pPaper系列母质粒和pScissors系列母质粒，其中，每种母质粒除能表达用于编辑目的基因的sgRNA外，还能表达靶向另外两种母质粒中的一种的sgRNA；在实施基因编辑过程中，由上述三种母质粒构建的基因编辑质粒循环使用时，宿主细胞中先使用的基因编辑质粒或筛选标记被后使用的基因编辑质粒所消除。本发明专利技术缩短了编辑周期、加快了多轮基因编辑速度，更少的培养次数还可以减少基因组自发突变的可能。

A gene editing tool and its preparation method and multi round gene editing method

【技术实现步骤摘要】
一种基因编辑工具及其制备方法与多轮基因编辑的方法
本专利技术属于基因工程
，具体涉及一种基因编辑工具及其制备方法与多轮基因编辑的方法。
技术介绍
基因编辑被广泛地应用到多种物种的改造，被广泛地应用于基础科研以及应用研究。比如通过基因编辑的手段，大量满足不同需求的菌株被成功构建。经典的细菌基因编辑方法是通过噬菌体来源的重组酶(如λRed，RecET)介导的同源重组完成的。这种方案一般包括两个步骤。第一步，同源片段被重组进特定基因组位置，但是由于重组效率低，在此步骤必须同时引入筛选标记。第二步，去除第一步中的筛选标记，从而在多轮基因编辑中重复使用相同的筛选标记。在第二步中，尽管已有多种去除方法，但是去除效率都不是100％，因此需要挑取单克隆进行分离以及验证。这些使得现有方法费时费力。近几年CRISPR/Cas方法也被广泛地应用到多种物种的基因编辑，其中包括多种细菌的基因组改造。Cas蛋白的高效核酸酶活性导致基因组形成双链断裂，形成了一个强大的负筛，仅有重组成功的细胞才能存活，因此这种方法仅需要一次重组。但是由于在编辑不同基因时，需要引本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种基因编辑工具，其特征在于，包括如下三种sgRNA表达母质粒，分别为pRock系列母质粒、pPaper系列母质粒和pScissors系列母质粒，其中，每种母质粒除含有表达用于编辑目的基因的sgRNA外，还含有表达靶向另外两种母质粒中的一种的sgRNA；在实施基因编辑过程中，由上述三种母质粒构建的系列基因编辑质粒循环使用时，宿主细胞中先使用的基因编辑质粒或筛选标记被后使用的基因编辑质粒所消除。/n

【技术特征摘要】
1.一种基因编辑工具，其特征在于，包括如下三种sgRNA表达母质粒，分别为pRock系列母质粒、pPaper系列母质粒和pScissors系列母质粒，其中，每种母质粒除含有表达用于编辑目的基因的sgRNA外，还含有表达靶向另外两种母质粒中的一种的sgRNA；在实施基因编辑过程中，由上述三种母质粒构建的系列基因编辑质粒循环使用时，宿主细胞中先使用的基因编辑质粒或筛选标记被后使用的基因编辑质粒所消除。


2.根据权利要求1所述的基因编辑工具，其特征在于，所述pRock系列母质粒携带四环素抗性基因表达模块以及用于质粒消除的引导RNA，所述引导RNA靶向pScissors系列母质粒中阿普拉霉素抗性基因编码区GATGGGCAGGTACTTCTCCT序列；所述四环素抗性基因表达模块正义链的5’端和反义链的5’两端分别带有TCAACCCAGTCAGCTCCTTCAGG和TCAACCCAGTCAGCTCCTTCTGG序列；
所述pPaper系列母质粒携带氯霉素抗性基因表达模块以及用于质粒消除的引导RNA，所述引导RNA靶向pRock系列质粒中四环素抗性基因编码区TCAACCCAGTCAGCTCCTTC序列；所述氯霉素抗性基因表达模块正义链的5’端和反义链的5’两端分别带有TCGCAAGATGTGGCGTGTTAAGG和TCGCAAGATGTGGCGTGTTATGG序列；
所述pScissors系列母质粒携带阿普拉霉素抗性基因表达模块以及用于质粒消除的引导RNA，所述引导RNA靶向pPaper系列质粒中氯霉素抗性基因编码区TCGCAAGATGTGGCGTGTTA序列；所述阿普拉霉素抗性基因表达模块正义链的5’端和反义链的5’两端分别带有GATGGGCAGGTACTTCTCCTAGG和GATGGGCAGGTACTTCTCCTTGG序列。


3.根据权利要求1所述的基因编辑工具，其特征在于，所述pRock系列母质粒、pPaper系列母质粒和pScissors系列母质粒均包含序列TCTGCTAATCCTGTTACCAGTGG。


4.根据权利要求2所述的基因编辑工具，其特征在于，每种母质粒中用于质粒消除的引导RNA的启动子为PlacIQ，核苷酸序列如SEQIDNO.1所示；用于编辑目的基因的sgRNA的启动子为J23119，核苷酸序列如SEQIDNO.2所示；每种母质粒中用于质粒消除的引导RNA表达模块与用于编辑目的基因的sgRNA表达模块在质粒中分别被复制起始序列和抗性基因表达模块隔开，所述复制起始序列核苷酸序列如SEQIDNO.3所示。


5.根据权利要求1所述的基因编辑工具，其特征在于，所述pRock系列母质粒的核苷酸序列如SEQIDNO.4所示，所述pPaper系列母质粒的核苷酸序列如SEQIDNO.5所示，所述pScissors系列母质粒的核苷酸序列如SEQIDNO.6所示。


6.权利要求1-5任意一项所述的基因编辑工具的制备方法，其特征在于，步骤如下：
(1)共同模板质粒pRPS的构建：
将用于消除质粒的引导RNA框架表达模块、复制起始序列p15A与壮观霉素抗性基因表达模块连接后转化大肠杆菌，经筛选鉴定后提取获得重组质粒，记为pRPS质粒；
(2)pRock系列母质粒构建：
a.抗性替换：以步骤(1)获得的pRPS质粒为模板，扩增获得除壮观霉素抗性基因之外的序列；以pSB1T3质粒为模板，扩增获得四环素抗性基因表达模块；上述两个扩增片段连接后转化大肠杆菌，筛选后提取获得具有四环素抗性的质粒，记为pRPS-T质粒；
b.靶向序列引入：将寡核苷酸BsaI-G.S35F，序列为5’cgccgatgggcaggtacttctcct3’与BsaI-G.S35R，序列为5’aaacaggagaagtacctgcccatc3’进行等摩尔浓度比例混合，以0.1℃/s的速度从98℃缓慢降温到16℃，得到的产物与BsaI酶切后的pRPS-T质粒连接，转化大肠杆菌，筛选后提取质粒，记为pRPS-TkG质粒；
c.用于目的基因编辑的sgRNA框架引入：以pTarget质粒为模板，扩增得到用于编辑目的基因的sgRNA表达模块，插入到所述pRPS-TkG质粒中，转化大肠杆菌，筛选后提取质粒，即为pRock系列母质粒；
(3)pPaper系列母质粒构建：
a.抗性替换：以步骤(1)获得的pRPS质粒为模板，扩增获得除壮观霉素抗性基因之外的序列；以pSB1C3质粒为模板，扩增获得氯霉素抗性基因表达模块；上述两个扩增片段连接后转化大肠杆菌，筛选后提取获得具有氯霉素抗性的质粒，记为pRPS-C质粒；
b.靶向序列引入：将寡核苷酸BsaI-T.S53F，序列为5’cgcctcaacccagtcagctccttc3’与BsaI-T.S53R，序列为5’aaacgaaggagctgactgggttga3’进行等摩尔浓度比例混合，以0.1℃/s的速度从98℃缓慢降温到16℃，得到的产物与BsaI酶切后的pRPS-C质粒利用DNA连接，转化大肠杆菌，筛选后提取质粒，记为pRPS-CkT质粒；
c.用于目的基因编辑的sgRNA框架引入：以pTarget质粒为模板，扩增得到用于编辑目的基因的sgRNA表达模块；插入到所述pRPS-CkT质粒中，转化大肠杆菌，筛选后提取质粒，即为pPaper系列母质粒；
(4)pScissors系列母质粒构建
a.抗性替换：以步骤(1)获得的pRPS质粒为模板，扩增获得除壮观霉素抗性基因之外的序列；以pMDIAI质粒为模板，扩增获得阿普拉霉素抗性基因表达模块；上述两个扩增片段连接后转化大肠杆菌，筛选后提取获得具有阿普拉霉素抗性的质粒，记为pRPS-G质粒；...

【专利技术属性】
技术研发人员：赵广，咸漠，王纪超，隋新悦，
申请(专利权)人：中国科学院青岛生物能源与过程研究所，
类型：发明
国别省市：山东;37