不耐热溶血素TLH的核酸适配体TLH01及其应用制造技术

本发明专利技术涉及一种不耐热溶血素TLH的核酸适配体TLH01及其应用，该核酸适配体TLH01的序列包括：5'‑GCGCCACCCCGACAGCGGTAGACAAACTC‑3'。本发明专利技术的核酸适配体TLH01能高亲和力、高特异性地与不耐热溶血素TLH结合，在环境监测、临床医学，以及研究副溶血性弧菌TLH的生物学功能等领域中均具有广泛的应用价值和广阔的市场前景。

【技术实现步骤摘要】
不耐热溶血素TLH的核酸适配体TLH01及其应用
本专利技术涉及生物
，特别是涉及一种不耐热溶血素TLH的核酸适配体TLH01及其应用。
技术介绍
副溶血性弧菌又称嗜盐菌，属于弧菌科弧菌属，是一种感染家畜和人的革兰氏阴性菌，广泛分布于近岸海水、海底沉积物、海鲜和腌渍食品中。微生物食物中毒的主要临床症状是急性肠炎，表现为胃痛、腹泻、呕吐，其潜伏期通常是8-20h，平均12h，病程一般2-3天，可以完全康复，预后良好，少数严重病人会因救治不及时而死亡。副溶血性弧菌中毒与含有该细菌的食物有关，吃或吃不煮生的海鲜污染或腌渍食品是其主要传播途径。已知的重要传染源有被病菌污染的蟹、虾、扇贝、牡蛎、蛤类、海蜇、墨鱼片、咸菜、肉鸡等，副溶血性弧菌的最适生长温度为37℃，因此副溶血性弧菌中毒的高发期在夏、秋两季，8月为高峰期。近年来，副溶血性弧菌感染已经在我国食品中毒中排名第一位，因此，建立快速、便捷的检测方法是预防副溶血性弧菌中毒的有效途径。目前已经建立的副溶血性弧菌检测方法包括：增菌培养法、最大可能计数法等病原菌检测方法，酶联免疫吸附法、芯片法、放射性胶体金法、免疫传感器法、免疫磁珠法等抗原、抗体检测方法，PCR法、多重PCR、荧光定量PCR、纳米PCR、EMA-PCR法、核酸探针法、LAMP法等病原体基因检测方法。这些方法在快速、简便、灵敏度等方面还需进一步提高。副溶血性弧菌的不耐热溶血素(TLH)是一种非典型的磷脂酶，具有溶血活性。利用TLH蛋白免疫小鼠，制备抗TLH多克隆抗体，可建立酶联免疫吸附法试剂盒。TLH具有种属特异性，通过检测TLH可用于副溶血性弧菌的检测以及为感染情况提供依据。但抗体作为TLH检测的识别元件，存在制备复杂、价格昂贵、试剂需要冷链保存等缺陷。
技术实现思路
基于此，本专利技术的目的是提供一种核酸适配体TLH01，其能够特异性识别副溶血性弧菌的不耐热溶血素TLH。具体技术方案如下：一种不耐热溶血素TLH的核酸适配体TLH01，其序列包括如SEQIDNO.1所示的序列。其中，所述SEQIDNO.1如下所示：5'-GCGCCACCCCGACAGCGGTAGACAAACTC-3'(SEQIDNO.1)。在其中一些实施例中，在25℃，100mMNa+，1mMMg2+的条件下，所述核酸适配体TLH01的空间结构如下：在其中一些实施例中，对所述核酸适配体TLH01的5’端或3’端进行FITC、氨基、生物素或地高辛化学修饰。本专利技术的另一目的是提供一种核酸适配体，其是对上述的核酸适配体TLH01的SEQIDNO.1序列部分进行缺失或者替换1～3个碱基后所得序列。进一步地，如附图4所示，将SEQIDNO.1所示序列的碱基从5’端→3’端，按照1→29的顺序进行编号，所述核酸适配体是对上述核酸适配体TLH01的SEQIDNO.1序列部分的第5号～14号碱基和/或第22号～26号碱基进行缺失或者替换1～3个碱基(即1个、2个或3个)后所得序列。本专利技术的另一目的是提供一种上述的核酸适配体TLH01或上述的核酸适配体在制备检测不耐热溶血素TLH的检测试剂盒中的应用。本专利技术的另一目的是提供一种上述的核酸适配体TLH01或上述的核酸适配体在制备检测不耐热溶血素TLH的分子探针的应用。本专利技术的另一目的是提供一种上述的核酸适配体TLH01或上述的核酸适配体在制备检测不耐热溶血素TLH的药物中的应用。本专利技术的另一目的是提供一种上述的核酸适配体TLH01或上述的核酸适配体在制备检测副溶血性弧菌的检测试剂盒、分子探针或药物中的应用。本专利技术的另一目的是提供一种上述的核酸适配体TLH01或上述的核酸适配体在非疾病诊断和治疗目的的检测副溶血性弧菌或不耐热溶血素TLH中的应用。本专利技术的再一目的是提供一种检测试剂盒，其包括上述的核酸适配体TLH01或上述的核酸适配体。与现有技术相比，本专利技术具有以下有益效果：本专利技术的核酸适配体TLH01可以高亲和力、高特异性地识别副溶血性弧菌的不耐热溶血素TLH，对其他副溶血性弧菌溶血素不具有识别功能，在环境监测、临床医学，以及研究副溶血性弧菌TLH的生物学功能等领域中均具有广泛的应用价值和广阔的市场前景。本专利技术的核酸适配体TLH01相比蛋白类抗体更加稳定，可直接体外合成和标记，不需要二抗，操作简单、迅速。本专利技术的核酸适配体TLH01较抗体的制备成本低，周期短，且重现性好。附图说明图1为凝胶迁移阻滞实验检测副溶血性弧菌TLH的结果；图2为酶联免疫吸附方法检测副溶血性弧菌TLH的结果；图3为核酸适配体TLH01的饱和结合曲线；图4为核酸适配体TLH01的空间结构。具体实施方式本专利技术下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，或按照制造厂商所建议的条件。实施例中所用到的各种常用化学试剂，均为市售产品。除非另有定义，本专利技术所使用的所有的技术和科学术语与属于本专利技术的
的技术人员通常理解的含义相同。本专利技术的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施例的目的，不用于限制本专利技术。本专利技术的术语“包括”和“具有”以及它们任何变形，意图在于覆盖不排他的包含。例如包含了一系列步骤的过程、方法、装置、产品或设备没有限定于已列出的步骤或模块，而是可选地还包括没有列出的步骤，或可选地还包括对于这些过程、方法、产品或设备固有的其它步骤。在本专利技术中提及的“多个”是指两个或两个以上。“和/或”，描述关联对象的关联关系，表示可以存在三种关系，例如，A和/或B，可以表示：单独存在A，同时存在A和B，单独存在B这三种情况。字符“/”一般表示前后关联对象是一种“或”的关系。以下结合具体实施例对本专利技术作进一步详细的说明。本专利技术的核酸适配体TLH01是通过以毕赤酵母表达的TLH为靶标，经本专利技术的专利技术人筛选获得。该TLH01的长度为29个碱基，序列如下：5'-GCGCCACCCCGACAGCGGTAGACAAACTC-3'(SEQIDNO:1)。所述的副溶血性弧菌TLH的核酸适配体TLH01，根据mfold平台分析结果，在25℃，100mMNa+，1mMMg2+的条件下，其空间结构如下：实施例一以核酸适配体TLH01为识别元件，采用凝胶迁移阻滞实验检测副溶血性弧菌TLH(1)合成TLH01序列，在其5'端标记荧光基团FITC(上海生工公司合成)，序列为：5'-GCGCCACCCCGACAGCGGTAGACAAACTC-3'。(2)将FITC标记的核酸适配体TLH01溶解于合适体积的缓冲液中(50mMTris-HCl，100mMNaCl，1mMMgCl2，5mMKCl，pH7.4)，核酸适配体TLH01的浓度为1mM；然后经热激活处理。热激活处理的方法为：95℃变性5min后，立即置于冰水浴中10min，随后置于室温10min。(3)将经热激活本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种不耐热溶血素TLH的核酸适配体TLH01，其特征在于，其序列包括如SEQ ID NO.1所示的序列。/n

【技术特征摘要】
1.一种不耐热溶血素TLH的核酸适配体TLH01，其特征在于，其序列包括如SEQIDNO.1所示的序列。


2.根据权利要求1所述的核酸适配体TLH01，其特征在于，在25℃，100mMNa+，1mMMg2+的条件下，所述核酸适配体TLH01的空间结构包括：





3.根据权利要求1或2所述的核酸适配体TLH01，其特征在于，对所述核酸适配体TLH01的5’端或3’端进行FITC、氨基、生物素或地高辛化学修饰。


4.一种核酸适配体，其特征在于，其是对权利要求1～3任一项所述核酸适配体TLH01的SEQIDNO.1序列进行缺失或者替换1～3个碱基后所得序列。


5.权利要求1～3任一项所述的核酸适配体TLH01或权利要求4所述的核酸适配体在制备检测不耐热溶血素TLH的检测试...

【专利技术属性】
技术研发人员：杨湘越，王娅，黄来荣，曹鹏，
申请(专利权)人：福州金域医学检验所有限公司，
类型：发明
国别省市：福建;35