一种心脏细胞外泌体的制备和应用制造技术

本发明专利技术公开了一种心脏细胞外泌体的制备和应用。本发明专利技术的目的在于提供一种治疗心血管及肢体缺血性疾病的外泌体，它制备方法简单，高效低毒，能有效预防和治疗心肌梗死相关疾病和肢体缺血性疾病。具体涉及从人心脏组织中提纯一种c‑Kit+细胞，培养方法，分离外泌体方法，该外泌体分离方法克服了传统方法的不足，产量高、周期短、效果好。此外，临床上尚无有效治疗心肌梗死后导致的心衰、心肌肥大以及室壁瘤的有效药物，该外泌体可以在体外促进人脐静脉内皮细胞的血管新生，体内局部注射使用可有效改善肢体缺血的组织和血管的修复，可应用于治疗心肌梗死导致的心衰、心肌肥大、室壁瘤、肢体缺血等，药理作用明确，用量很小，无毒副作用。

【技术实现步骤摘要】
一种心脏细胞外泌体的制备和应用
本专利技术属于生物医药
,具体涉及一种心脏细胞外泌体的制备和应用。
技术介绍
本专利技术所述心脏细胞，为心脏c-Kit+细胞，它是心脏组织中未成熟分化的一小群心脏细胞，可以分化为前体细胞，心脏c-Kit+细胞具有促进心肌细胞增殖、抑制细胞凋亡、促进血管生成、减少心肌纤维化等有益作用，能够增加心肌血流量，减轻炎症反应，缩小心肌梗死后瘢痕面积，预防缺血/再灌注后心肌损伤，从而改善心脏功能。根据心脏细胞的不同特性和表面标志物进行鉴定，心脏祖细胞可作如下分类：c-Kit+、侧群干细胞、Sca-1+、心肌球细胞簇和心肌球来源的细胞簇等。其中，c-Kit+心脏细胞是发现最早且研究最为广泛和深入的一类心脏细胞。本专利技术所述的心脏c-Kit+细胞外泌体，不同类型的细胞包括心脏细胞，在正常或病理条件下均可分泌外泌体，产生外泌体的细胞来源不同，生物学功能也不尽相同。外泌体携带有分泌细胞来源的蛋白质、脂质、核酸、细胞因子、病原体以及自身抗原等生物活性分子，包括mRNA、miRNA、长链非编码RNA(LncRNA)和DN本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种心脏细胞外泌体的制备和应用，其特征在于：具体制备步骤为：/n步骤一：心脏组织处理：收集手术后即将弃用的心肌组织，剪成大小1mm3的组织碎块，放入无钙心脏停跳液，再用心脏细胞消化分离液分离心脏组织中的所有心脏细胞，使用微孔滤网过滤；/n步骤二：获取大量心脏细胞：用心脏细胞专用培养基大量扩增；/n步骤三：分选c-Kit+细胞：用免疫磁珠分选方法筛选出人心脏c-Kit+细胞；/n步骤四：收集培养基：用心脏细胞专用培养基扩增培养筛选出的心脏c-Kit+细胞，待细胞融合至80-90％时，加入无血清无外泌体的IMDM培养基，培养48-72小时；/n步骤五：获取外泌体，应用梯度离心法分离得到外泌体，...

【技术特征摘要】
1.一种心脏细胞外泌体的制备和应用，其特征在于：具体制备步骤为：
步骤一：心脏组织处理：收集手术后即将弃用的心肌组织，剪成大小1mm3的组织碎块，放入无钙心脏停跳液，再用心脏细胞消化分离液分离心脏组织中的所有心脏细胞，使用微孔滤网过滤；
步骤二：获取大量心脏细胞：用心脏细胞专用培养基大量扩增；
步骤三：分选c-Kit+细胞：用免疫磁珠分选方法筛选出人心脏c-Kit+细胞；
步骤四：收集培养基：用心脏细胞专用培养基扩增培养筛选出的心脏c-Kit+细胞，待细胞融合至80-90％时，加入无血清无外泌体的IMDM培养基，培养48-72小时；
步骤五：获取外泌体，应用梯度离心法分离得到外泌体，将外泌体溶于PBS中，制为针剂。


2.根据权利要求1所述的一种心脏细胞外泌体的制备和应用，其特征在于：所述无钙心脏停跳液的配方如下，磷酸二氢钾6.81g、硫酸镁1.97g、腺苷1.34g、甘露醇18.22g、葡萄糖25.22g、HEPEs2.38g、牛磺酸1.25g，用超纯水搅拌溶解，氢氧化钾调节pH为7.3-4，定容至1L，继而用0.22μmMillipore滤膜过滤除菌，使用前用纯氧气充气5分钟。


3.根据权利要求1所述的一种心脏细胞外泌体的制备和应用，其特征在于：所述心脏细胞消化分离液为，1L灭菌水里包含氯化钠8.00g、氯化钾0.20g、磷酸氢二钠1.15g、磷酸二氢钾0.20g、用去离子水搅拌溶解，盐酸或氢氧化钠调节pH为7.4、高压灭菌，在使用时每5ml心脏细胞消化分离液中再加入0.05ml青霉素-链霉素100x混合液，0.2gII型胶原酶和0.2g胰蛋白酶。


4.根据权利要求1所述的一种心脏细胞外泌体的制备和应用，其特征在于：所述微孔滤网过滤微孔滤膜孔径为0.45微米。


5.根据权利要求1所述的一种...

【专利技术属性】
技术研发人员：李刚，
申请(专利权)人：李刚，
类型：发明
国别省市：新疆;65