一种具有抑菌和抗病毒能力的乳酸菌菌株分离鉴定方法及应用技术

本发明专利技术属于微生物技术领域，尤其涉及一种具有抑菌和抗病毒能力的乳酸菌菌株分离鉴定方法及应用，本方法通过选择健康安全的小猪作为供体，在制备乳酸菌液时对其粪便进行筛选鉴定，降低了粪菌中有害菌存在的潜在风险；引物通过华大基因公司合成：27f：5’‑AGAGTTTGATCCTGGCTCAG‑3’，1492r：5’‑GGTTACCTTGTTACGACTT‑3’。PCR产物送交华大基因公司进行测序，将测序结果用BLAST与GenBank数据库中已知的菌株进行同源性比对，发现该菌株与NCBI中GenBank的16sRNA的同源性均达99.99％。结果显示该菌种为猪源罗伊氏乳酸菌，命名为HRB1，菌液上清液能够与病毒直接接触后发挥抑制作用，从而降低病毒毒力。

【技术实现步骤摘要】
一种具有抑菌和抗病毒能力的乳酸菌菌株分离鉴定方法及应用
本专利技术属于微生物
，尤其涉及一种具有抑菌和抗病毒能力的乳酸菌菌株分离鉴定方法及应用。
技术介绍
畜禽细菌性、病毒性疾病严重威胁着养殖业的发展,某些人畜共患病还威胁着人类健康。乳酸菌通过自身生理活动中产生的一系列代谢产物或菌体组成成分，阻断致病菌的定植、侵入、繁殖以及病毒吸附、穿入、生物合成、装配和释放中的某一环节或某几个环节而直接抑制病毒和细菌,并通过提高机体的免疫功能,促进机体的特异性和非特异性免疫功能而间接抑制病毒和细菌。研究和开发抗畜禽细菌和病毒的乳酸菌有极广阔的前景。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种从粪便中制备乳酸菌液的方法，以解决上述
技术介绍
中提出的问题。为实现上述目的，本专利技术提供如下技术方案：所述一种具有抑菌和抗病毒能力的乳酸菌菌株，通过以下方法获得：步骤a：菌株的分离与纯化通过分菌实验进行；步骤b:通过形态、生理生化和分子鉴定相结合的方法对上述保存菌种的形态特征、生理生化特征以及16sRNA基因序列进行鉴定；所述菌株的分离与纯化分菌实验包括以下步骤：(1)选择健康供体，采取供体粪便；(2)准确称取粪便0.5g，加入4.5mL无菌生理盐水，制备混悬液；(3)将混悬液进行梯度稀释，再将10-2、10-3、10-4混悬液分别涂布于含1.5％CaCO3的MRS固体培养基中，37℃条件下厌氧培养45h；(4)待菌落长出后，挑选出明显具有碳酸钙溶解圈的单个菌落于MRS固体培养基上进行3次划线纯化，挑取碳酸钙溶解圈最大的菌落于MRS肉汤培养基中培养24h并保存其菌种。进一步的，所述乳酸菌是从猪只粪便中分离制备获得,并且是PRRSV疫苗保护组猪只的不同时间点粪便，选取抗体水平较高、清除病毒能力强的猪只粪便进行分菌试验。进一步的，选取培养24h的菌液5mL，按照细菌基因组DNA提取试剂盒说明书提取细菌DNA，使用细菌16SrRNA通用引物(27f-1492r)进行基因扩增。本专利技术的有益效果为：本方法通过选择健康安全的小猪作为供体，在制备乳酸菌液时对其粪便进行筛选鉴定，降低了粪菌中有害菌存在的潜在风险；引物通过华大基因公司合成：27f：5’-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’，1492r：5’-GGTTACCTTGTTACGACTT-3’。PCR产物送交华大基因公司进行测序，将测序结果用BLAST与GenBank数据库中已知的菌株进行同源性比对，发现该菌株与NCBIGenBank中罗伊氏乳酸菌的16sRNA的同源性均达99.99％。结果显示该菌种为猪源罗伊氏乳酸菌，命名为HRB1，菌液及其上清液能抑制致病菌繁殖，菌株上清液能够与病毒直接接触后发挥抑制作用，从而降低病毒毒力。附图说明图1为本专利技术的菌液实验显微镜照片；图2为本专利技术的CCK-8实验结果图；图3为本专利技术的处理组实验结果对照图；本专利技术目的的实现、功能特点及优点将结合实施例，参照附图做进一步说明。具体实施方式应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本专利技术，并不用于限定本专利技术。结合图1-图3所示，本实施例公开的一种具有抑菌和抗病毒能力的乳酸菌菌株分离鉴定方法及应用，该方法由如下步骤组成：实施例1HRB1对病原菌体外抑制效果实验：S1，将分离菌复壮后划线培养选取溶钙圈最大的菌落，用接种环挑取一菌环接种于20mLMRS肉汤培养基中，37℃培养24h得到种子液；S2，吸取0.1mL的种子液接种于10mLMRS肉汤培养基中，37℃培养24h。S3，收取菌液，一部分菌液5000r/min离心5min，收取上清用0.22μm的滤膜过滤。体外抑菌试验采用琼脂打孔法，首先，复苏大肠杆菌K88、沙门氏菌S50333、金黄色葡萄球菌CMCC等3种指示菌；菌种复苏后，接种环分别挑取单个菌落于液体培养基进行增菌；先向无菌平皿中加入20mL左右1.5％的LB琼脂培养基，水平静置；待其凝固后，接种0.1mL指示菌菌液(108CFUmL-1)，涂布均匀；用琼脂打孔器打孔(直径12mm)，取200μL菌液/上清加入孔中；将培养皿正向置于4℃预扩散2h，37℃培养24h，测定抑菌圈大小，每种指示菌进行三次重复，结果表明HRB1具有较好的抑菌效果，结果入图1所示。实施例2HRB1对病毒体外抑制效果实验：S1将分离菌复壮后划线培养选取溶钙圈最大的菌落，用接种环挑取一菌环接种于20mLMRS肉汤培养基中，37℃培养24h得到种子液；S2吸取0.1mL的种子液接种于10mLMRS肉汤培养基中，37℃培养24h；S3紫外分光光度计检测菌液OD600值，待其OD600值＝2时收取菌液，5000r/min离心5min，收取上清液用0.22μm的滤器过滤；S4将过滤后的上清液用无血清的DMEM倍比稀释至32，取生长良好的Marc-145细胞,配成单细胞悬液,稀释成1×105个/mL；加至96孔板,每孔100μL,在37℃、50mL·L-1CO2培养箱内培养24h,弃去原培养液,分别加入含1/2、1/4、1/8、1/16、1/32上清液的无血清DMEM以及无血清DMEM并设置只含无血清DMEM不含细胞的空白孔，继续培养；分别于作用2h、4h后向各孔分别加入CCK-8试剂10μL，37℃继续孵育4h，酶标仪测定各孔吸光度值(测定波长450nm)；如图2所示上清液对细胞的毒性作用随浓度的降低而减小呈剂量依赖性，与对照组相比，含1/8浓度上清液的DMEM对细胞的毒性作用已不显著。根据CCK-8结果(图2)，选定1/10浓度的上清液检测其对病毒的抑制作用，病毒接种浓度为0.1MOI。取生长良好的Marc-145细胞,配成单细胞悬液,稀释成1×105个/mL；加至12孔板,每孔1mL,在37℃、50mL·L-1CO2培养箱内培养24h，试验共设置五个处理组，具体处理如下：处理组1：每孔细胞加入500μL病毒液，1ml，孵育4h后弃上清，加500μL菌液上清，孵育2h后弃上清液，换2％维持液继续培养；处理组2：每孔细胞加入500μL菌液上清，孵育2h后弃上清液，每孔加入500μL病毒液，孵育4h后弃上清液，换2％维持液继续培养；处理组3：每孔细胞加入500μL(250μL(1/4浓度)菌液上清和250μL(0.2MOI)病毒液)，孵育4h后弃上清液，换2％维持液继续培养；处理组4：病毒和菌液上清于37℃共孵育2h后，加入细胞每孔500μL(250μL(1/4浓度)菌液上清和250μL(0.2MOI)病毒液)，孵育4h后弃上清液，换2％维持液继续培养；对照组：每孔细胞加入500μL病毒液，孵育4h后弃上清液，换2％维持液继续培养。所有组均于病毒感染后24h收集上清液用TCID50检测病毒毒力。结果图3所示，处本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种具有抑菌和抗病毒能力的乳酸菌菌株分离鉴定方法及应用，其特征在于，该方法由如下步骤组成：/n步骤a：菌株的分离与纯化通过分菌实验进行；/n步骤b:通过形态、生理生化和分子鉴定相结合的方法对上述保存菌种的形态特征、生理生化特征以及16sRNA基因序列进行鉴定；/n所述菌株的分离与纯化进行分菌实验包括以下步骤：/n(1)选择健康供体，采取供体粪便；/n(2)准确称取粪便0.5g，加入4.5mL无菌生理盐水，制备混悬液；/n(3)将混悬液进行梯度稀释，再将10

【技术特征摘要】
1.一种具有抑菌和抗病毒能力的乳酸菌菌株分离鉴定方法及应用，其特征在于，该方法由如下步骤组成：
步骤a：菌株的分离与纯化通过分菌实验进行；
步骤b:通过形态、生理生化和分子鉴定相结合的方法对上述保存菌种的形态特征、生理生化特征以及16sRNA基因序列进行鉴定；
所述菌株的分离与纯化进行分菌实验包括以下步骤：
(1)选择健康供体，采取供体粪便；
(2)准确称取粪便0.5g，加入4.5mL无菌生理盐水，制备混悬液；
(3)将混悬液进行梯度稀释，再将10-2、10-3混悬液分别涂布于含1.5％CaCO3的MRS固体培养基中，37℃条件下厌氧培养45h；
(4)待菌落长出后，挑选出明显具有碳酸钙溶解圈的...

【专利技术属性】
技术研发人员：王玉娥，陈洪岩，马文杰，张贺，
申请(专利权)人：王玉娥，
类型：发明
国别省市：黑龙江;23