一株霍乱弧菌拮抗株及其应用制造技术

本发明专利技术属于微生物技术领域，提供了一株霍乱弧菌拮抗株及其应用。所述菌株为枯草芽孢杆菌(Bacillus subtills)H

【技术实现步骤摘要】
一株霍乱弧菌拮抗株及其应用
本专利技术属于微生物
，提供了一株霍乱弧菌拮抗株及其应用。
技术介绍
霍乱弧菌隶属于变形菌纲，弧菌属(Vibrio)，广泛存在于江河、海水以及鱼、虾和贝类等水产品中。养殖水体中的霍乱弧菌生命力强，对营养需求低，在水产养殖水体易繁殖，霍乱弧菌属于条件致病菌，一旦水体环境恶化，水产动物自身抵抗力减弱，霍乱弧菌就会乘虚而入对动物体造成伤害，主要表现症状包括偷死、白便、溃疡、生长缓慢等，且一旦爆发，就会导致大量水产动物的死亡且难以控制，严重者就造成绝产。另外，摄入致病性霍乱弧菌污染的水或水产品可引起致死性脱水性腹泻，甚至导致霍乱疾病的暴发流行。目前抗生素与消毒剂相结合的化学性治疗是当前水产养殖业用于弧菌病防治的主要手段，养殖过程中抗生素及其它化学药剂的过量、密集使用将增加病原菌的耐药性、抗药性，同时还会对养殖水体造成污染，降低养殖生物的免疫力，此外，人们食用这些被化学药剂过渡污染的水产产品会对人体产生伤害。近些年益生菌在水产养殖中的研究越来越受到关注，经研究发现益生菌在水产养殖中的作用主要表现为竞争性排斥病原菌、提供营养物质，促进养殖动物的生长、刺激免疫系统反应，提高免疫力、改善水质条件，修复生态环境等。但目前未见有防治水产养殖中霍乱弧菌的有效菌株及防治方法，该问题亟待解决。
技术实现思路
为了解决现有技术缺陷，本专利技术提供了一株霍乱弧菌拮抗菌株，该菌株是以某水产养殖基地常见霍乱弧菌为指示菌进行拮抗株的分离、筛选、诱变，得到的对霍乱弧菌抑制力强、益生效果优益的菌株，对水产养殖中导致的弧菌病原微生物有非常优异的抑制作用，尤其是对霍乱弧菌效果更加突出，应用时将该菌株或其制备的菌剂应用于养殖水池，对水体中霍乱弧菌的抑制率可达99.99％，且不会影响养殖水体环境，从而降低了水产动物感染霍乱弧菌的风险。本专利技术所述的霍乱弧菌拮抗菌株为枯草芽孢杆菌(Bacillussubtills)，编号YJY20-01，该菌株已于2020年6月保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCCNo.20013；其16SrDNA序列如SeqIDNo:1所示，该序列为菌株的16SrDNA的全序列；所测得的16SrDNA序列经过BLAST比对，与芽孢杆菌属(Bacillussp.)不同菌株的核苷酸序列有大于99％的同源性，与其中明确标记为枯草芽孢杆菌(Bacillussubtills)的菌株有100％同源性。该菌株为革兰氏阳性菌，无荚膜，杆状；普通营养琼脂平板上菌落呈圆形突起，菌落表明光滑不粗糙，呈奶白色，不透明。本专利技术的霍乱弧菌拮抗菌株YJY20-01来源如下：专利技术人从山东乔庄某水产养殖基地的多个虾池中分离出一株与霍乱弧菌拮抗效果最优、易于培养且有稳定的传代特性的枯草芽孢杆菌H6，以该菌株为出发菌株进行ARTP诱变，分离得到135株单菌，经拮抗初筛与共培养复筛后得到最优正突变株YJY20-01，培养过程中检测发现诱变株生长速率高于出发菌株，环境适应性非常好。该菌株可应用于水产养殖中防治霍乱弧菌，对其他弧菌引起的弧菌病也有较好的防治效果，应用时可以将该菌株直接投入到养殖水体中，或者将该菌株扩大培养制备成菌剂产品后投入到养殖水体中。优选的，应用时，养殖水体中霍乱弧菌拮抗菌株初始密度为霍乱弧菌密度的0.01-1倍，更优选为0.01-0.1倍。该密度范围内既能够快速的达到抑制霍乱弧菌的防治效果，又能够节约成本。且使用方法简单，用量少，易操作。综上所述，本专利技术的枯草芽孢杆菌YJY20-01对霍乱弧菌具有明显的拮抗作用，将该菌株用于水产养殖中，能够明显抑制水体中霍乱弧菌的繁殖，对养殖水体中霍乱弧菌的拮抗率48h可达99.99％，且持续性与稳定性均优于市场同类弧菌药剂，而不会对养殖水体造成污染，还能够一定程度上促进养殖动物的生长、刺激免疫系统反应，提高免疫力、改善水质条件，修复生态环境等。保藏信息保藏时间：2020年06月03日保藏单位名称：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏编号：CGMCCNo.20013保藏单位地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号分类命名：枯草芽孢杆菌Bacillussubtilis附图说明图1为实施例1平板拮抗实验结果；图2为实施例2生态养殖水池中霍乱弧菌菌量数量变化图；图3为实施例3室外养殖水池中霍乱弧菌菌量数量变化图。具体实施方式以下通过实施例形式的具体实施方式，对本专利技术的上述内容做进一步的详细说明，但不应将此理解为本专利技术上述主题范围仅限于以下的实例。凡基于本专利技术上述内容所实现的技术均属于本专利技术的范围，除特殊说明外，下述实施例中均采用常规现有技术完成。以下实施例中所涉及的霍乱弧菌均为山东乔庄某水产养殖基地水体中常见霍乱弧菌。实施例1菌株YJY20-01特性验证A.平板拮抗实验(拮抗初筛)：方法：分别将活化后的霍乱弧菌和拮抗菌株接种入新鲜的无菌LB液体培养基中，培养过夜，将拮抗菌株培养液分别进行离心(4500rpm，5min)收集菌体，并将其用无菌水稀释至106cfu/ml；取100μl霍乱弧菌涂布于新鲜的TCBS固体培养基中，用无菌打孔器在涂过霍乱弧菌的平板上等距离打2个直径10mm的已灭菌的孔，取10μl拮抗菌株稀释液滴于孔内，然后35℃培养箱中培养过夜，24h左右观察孔周围是否出现抑菌圈并测量其直径，如图1所示出发菌株与诱变株周围均出现透明圈，诱变株透明圈更大些。实验数据如表1所示：表1平板拮抗结果注：*为0.05≤P<0.1,**为0.01≤P≤0.05,***为P≤0.01B.共培养实验(共培养复筛)：取活化后的出发菌株H6、突变菌株YJY20-01、霍乱弧菌分别接种到LB液体培养基中培养过夜，将培养液进行离心(4500rpm,5min)收集菌体，然后用无菌水分别进行稀释至菌数为107cfu/ml；将出发菌株H6、突变菌株YJY20-01分别单独与霍乱弧菌接入同一个装有100ml稀释5倍的液体LB培养基的锥形瓶内共培养，另外设置空白对照(仅接种霍乱弧菌)，各菌株接种量为200μl菌体稀释液，37℃、150r/min培养24h。实验结果如表2所示：诱变株YJY20-01对霍乱弧菌的抑制率高达99.99999％(几乎为100％)，远远高出出发菌株H6，并且通过实验过程中对菌数的测定，可以看出在相同的霍乱弧菌环境中YJY20-01繁殖速率远远高于出发菌株H6，说明其环境适应性极强。表2共培养实验结果注：抑制率计算方法(本申请中的抑制率计算方法均采用此方法)：x为空白对照组培养后霍乱弧菌菌量(cfu/ml)；y为拮抗菌株与霍乱弧菌共培养后霍乱弧菌菌量(cfu/ml)。C.诱变株YJY20-01传代稳定性实验对菌株YJY20-01进本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一株霍乱弧菌拮抗菌株，其特征在于，为枯草芽孢杆菌(Bacillus subtills)，编号YJY20-01，该菌株已于2020年6月保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.20013。/n

【技术特征摘要】
1.一株霍乱弧菌拮抗菌株，其特征在于，为枯草芽孢杆菌(Bacillussubtills)，编号YJY20-01，该菌株已于2020年6月保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCCNo.20013。


2.权利要求1所述霍乱弧菌拮抗菌株在水产养殖中的应用。


3.权利要求1所述霍乱弧菌拮抗菌株在水产养殖中的应用方法，其特征在于，应用时可以将该菌株直接投...

【专利技术属性】
技术研发人员：马娜娜，张心青，杨传伦，车树刚，杨丹丹，冉新新，
申请(专利权)人：黄河三角洲京博化工研究院有限公司，
类型：发明
国别省市：山东;37