治疗糖尿病足的间质干细胞制剂及其应用制造技术

本发明专利技术属于生物技术领域，尤其涉及一种治疗糖尿病足的间质干细胞制剂，所述治疗糖尿病足的间质干细胞制剂包含：TSP4过表达的间质干细胞，所述TSP4过表达的间质干细胞的制备方法包括：以pCMV6‑TSP4质粒和FT106质粒载体设计引物，通过PCR扩增和DNA连接反应得到FT106‑TSP4‑GFP慢病毒表达质粒，然后采用慢病毒包装质粒psPAX2和pMD.2G共转染293T细胞得到FT106‑TSP4‑GFP慢病毒，在用获得的FT106‑TSP4‑GFP慢病毒感染所述间质干细胞，得到TSP4过表达的间质干细胞。本发明专利技术提供的制剂能促进血管生成和活化，从而提高制剂对糖尿病足的治疗效果。

【技术实现步骤摘要】
治疗糖尿病足的间质干细胞制剂及其应用
本专利技术属于生物
，尤其涉及一种治疗糖尿病足的间质干细胞制剂及其应用。
技术介绍
糖尿病足是指由于糖尿病血管病变、神经病变及其感染等综合因素，导致神经性病变使得下肢保护功能减退，大血管和微血管病变使动脉灌注不足致微循环障碍而引起足部疼痛、皮肤深溃疡甚至肢体坏疽的疾病状态。糖尿病足是糖尿病一种严重的并发症，是糖尿病患者致残，甚至致死的重要原因之一，不但给患者造成痛苦，而且给社会及家庭造成了沉重的医疗负担。临床上用于治疗糖尿病足的方法有药物治疗、血管重建和介入手术，然而，糖尿病患者多年老体弱，常患有心脑血管等疾病，不能耐受手术搭桥等刺激，且血管病变多累及小动脉，部分患者缺乏远端动脉流出道，不具备行血管搭桥和介入治疗的条件。因此，目前糖尿病足的临床治疗仍然非常棘手，难以取得令人满意的疗效，常常导致截肢甚至危及病患生命。目前，在糖尿病足的治疗中，干细胞疗法已经成为最有发展前景的治疗策略，应用干细胞移植为糖尿病足缺血损伤组织修复和功能恢复提供了希望。间充质干细胞，是一种具有自我更新、高度增殖和多系分化能力的细胞群。间质干细胞已被证实是一类具有多向分化潜能的干细胞，可以在一定的诱导条件下分化为骨、软骨、脂肪、神经、心肌等，参与不同组织的修复，还能够促进血管生成，既可以分化成为血管内皮细胞和平滑肌细胞，直接形成新的血管，同时还可以通过旁分泌VEGF、Ang-I、Ang-II等多种血管生成因子来参与血管的新生过程。但是，在实际应用中，由于间质干细胞在人体中的含量不高，例如：骨髓间质干细胞大约占据骨髓中单核细胞数量的0.001％至0.01％，在临床治疗中需要较大的采髓量，对患者年龄、身体条件、心理接受程度要求较高。且由于氧化应激、低氧等微环境改变使移植后间质干细胞的存活率非常低，新生血管形成速度慢等，极大地限制了间质干细胞在糖尿病足疾病中的治疗效果。
技术实现思路
本专利技术实施例的目的在于提供一种治疗糖尿病足的间质干细胞制剂，旨在解决现有间质干细胞由于在人体中含量不高，存活率非常低，形成速度慢等缺陷，极大地限制了间质干细胞在糖尿病足疾病中的应用和治疗效果技术问题。本专利技术实施例的另一目的在于提供一种治疗糖尿病足的间质干细胞制剂的应用。为了实现上述专利技术目的，本专利技术采用的技术方案如下：一种治疗糖尿病足的间质干细胞制剂，所述治疗糖尿病足的间质干细胞制剂包含：TSP4过表达的间质干细胞，所述TSP4过表达的间质干细胞的制备方法包括以下步骤：获取pCMV6-TSP4质粒和FT106质粒载体，根据所述pCMV6-TSP4质粒的基因编码区序列设计用于扩增TSP4的第一引物对，根据所述FT106质粒载体的基因编码区序列设计用于扩增FT106的第二引物对；分别以所述pCMV6-TSP4质粒和FT106质粒为模板，进行聚合酶链式反应扩增，分别扩增得到pCMV6-TSP4寡核苷酸链和FT106寡核苷酸链；通过DNA连接反应将所述pCMV6-TSP4寡核苷酸链连接到所述FT106寡核苷酸链中，得到连接产物FT106-TSP4-GFP慢病毒表达质粒；获取慢病毒载体psPAX2和pMD.2G，将所述FT106-TSP4-GFP慢病毒表达质粒与所述慢病毒载体psPAX2和pMD.2G共转染293T细胞，得到FT106-TSP4-GFP慢病毒；获取间质干细胞，用所述FT106-TSP4-GFP慢病毒感染所述间质干细胞，得到TSP4过表达的间质干细胞。优选地，所述第一引物对包括：第一上游引物:5’TATATAAGCAGAGCTATGCCGGCCCCACGCGCG3’第一下游引物:5’ATGGTCTTTGTAGTCATTATCCAAGCGGTCGAAACTCTGG3’。优选地，所述第二引物对包括：第二上游引物:5’GACTACAAAGACCATGACGG3’第二下游引物:5’AGCTCTGCTTATATAAACCTCCC3’。优选地，所述DNA连接反应的步骤包括：获取HD蛋白酶，按所述HD蛋白酶、所述pCMV6-TSP4寡核苷酸链和所述FT106寡核苷酸链的质量比为1：(1.5～2.5)：(1.5～2.5)，建立反应体系；将所述反应体系依次在35℃～40℃温度下反应5～10分钟、45℃～55℃温度下反应10～20分钟，得到FT106-TSP4-GFP慢病毒表达质粒。优选地，所述将所述FT106-TSP4-GFP慢病毒表达质粒与所述慢病毒载体psPAX2和pMD.2G共转染293T细胞的步骤包括：获取2.5M的CaCl2溶液，制备第一混合液，以所述第一混合液的质量百分比为100％计，所述第一混合液包括：10％～15％的所述2.5M的CaCl2溶液，0.015％～0.02％的所述psPAX2，0.005％～0.01％的所述pMD.2G，0.02％～0.03％的所述FT106-TSP4慢病毒表达质粒，余量为ddH2O；获取2*HBS缓冲溶液，将所述第一混合液添加到等体积的所述2*HBS缓冲溶液中，室温静置20～30分钟，得到DNA静置液；获取含有293T细胞的培养皿，将所述DNA静置液滴加入所述含有293T细胞的培养皿中培养，得到FT106-TSP4-GFP慢病毒。优选地，所述FT106-TSP4-GFP慢病毒感染所述间质干细胞的步骤包括：将所述间质干细胞接种到含有第一培养基的细胞培养瓶中，在温度为35℃～40℃的细胞培养箱中，培养至所述间质干细胞的密度为75％～85％，得到第一培养产物，其中，所述第一培养基为含有FBS和双抗的DMEM/F12培养基，且所述FBS的质量百分含量占所述第一培养基总质量的10％，所述双抗的质量百分含量占所述第一培养基总质量的1％；将所述第一培养产物的培养基更换为第二培养基，在35℃～40℃的条件下培养2～4小时，得到第二培养产物，其中，所述第二培养基为含有FBS的DMEM/F12培养基，且所述FBS的质量百分含量占所述第二培养基总质量的5％；将所述第二培养产物的培养基更换为慢病毒培养基，在35℃～40℃的条件下培养5～8小时，得到第三培养产物；将所述第三培养产物的培养基更换为第三培养基，培养48～72小时，得到TSP4过表达的间质干细胞，其中，所述第三培养基为包含有FBS和GM的DMEM/F12培养基，且所述FBS的质量百分含量占所述第三培养基总质量的5％，所述GM的质量百分含量占所述第三培养基总质量的1‰。优选地，所述慢病毒的培养基为包含有FBS，聚凝胺和FT106-TSP4-GFP慢病毒的上清液的DMEM/F-12培养基，其中，所述FBS的质量百分含量占所述慢病毒培养基总质量的5％，所述聚凝胺的浓度为8ng/ml·培养基，所述FT106-TSP4-GFP慢病毒的上清液的浓度为(0.5～1)ml/ml·培养基。优选地，所述间质干细胞选自：骨髓间质干细胞、脐带间质干细胞、胎盘间质干细胞本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种治疗糖尿病足的间质干细胞制剂，其特征在于，所述治疗糖尿病足的间质干细胞制剂包含：TSP4过表达的间质干细胞，所述TSP4过表达的间质干细胞的制备方法包括以下步骤：/n获取pCMV6-TSP4质粒和FT106质粒载体，根据所述pCMV6-TSP4质粒的基因编码区序列设计用于扩增TSP4的第一引物对，根据所述FT106质粒载体的基因编码区序列设计用于扩增FT106的第二引物对；/n分别以所述pCMV6-TSP4质粒和FT106质粒为模板，进行聚合酶链式反应扩增，分别扩增得到pCMV6-TSP4寡核苷酸链和FT106寡核苷酸链；/n通过DNA连接反应将所述pCMV6-TSP4寡核苷酸链连接到所述FT106寡核苷酸链中，得到连接产物FT106-TSP4-GFP慢病毒表达质粒；/n获取慢病毒载体psPAX2和pMD.2G，将所述FT106-TSP4-GFP慢病毒表达质粒与所述慢病毒载体psPAX2和pMD.2G共转染293T细胞，得到FT106-TSP4-GFP慢病毒；/n获取间质干细胞，用所述FT106-TSP4-GFP慢病毒感染所述间质干细胞，得到TSP4过表达的间质干细胞。/n

【技术特征摘要】
1.一种治疗糖尿病足的间质干细胞制剂，其特征在于，所述治疗糖尿病足的间质干细胞制剂包含：TSP4过表达的间质干细胞，所述TSP4过表达的间质干细胞的制备方法包括以下步骤：
获取pCMV6-TSP4质粒和FT106质粒载体，根据所述pCMV6-TSP4质粒的基因编码区序列设计用于扩增TSP4的第一引物对，根据所述FT106质粒载体的基因编码区序列设计用于扩增FT106的第二引物对；
分别以所述pCMV6-TSP4质粒和FT106质粒为模板，进行聚合酶链式反应扩增，分别扩增得到pCMV6-TSP4寡核苷酸链和FT106寡核苷酸链；
通过DNA连接反应将所述pCMV6-TSP4寡核苷酸链连接到所述FT106寡核苷酸链中，得到连接产物FT106-TSP4-GFP慢病毒表达质粒；
获取慢病毒载体psPAX2和pMD.2G，将所述FT106-TSP4-GFP慢病毒表达质粒与所述慢病毒载体psPAX2和pMD.2G共转染293T细胞，得到FT106-TSP4-GFP慢病毒；
获取间质干细胞，用所述FT106-TSP4-GFP慢病毒感染所述间质干细胞，得到TSP4过表达的间质干细胞。


2.如权利要求1所述的治疗糖尿病足的间质干细胞制剂，其特征在于，所述第一引物对包括：
第一上游引物:5’TATATAAGCAGAGCTATGCCGGCCCCACGCGCG3’
第一下游引物:5’ATGGTCTTTGTAGTCATTATCCAAGCGGTCGAAACTCTGG3’。


3.如权利要求1所述的治疗糖尿病足的间质干细胞制剂，其特征在于，所述第二引物对包括：
第二上游引物:5’GACTACAAAGACCATGACGG3’
第二下游引物:5’AGCTCTGCTTATATAAACCTCCC3’。


4.如权利要求1～3任意所述的治疗糖尿病足的间质干细胞制剂，其特征在于，所述DNA连接反应的步骤包括：
获取HD蛋白酶，按所述HD蛋白酶、所述pCMV6-TSP4寡核苷酸链和所述FT106寡核苷酸链的质量比为1：(1.5～2.5)：(1.5～2.5)，建立反应体系；
将所述反应体系依次在35℃～40℃温度下反应5～10分钟、45℃～55℃温度下反应10～20分钟，得到FT106-TSP4-GFP慢病毒表达质粒。


5.如权利要求1～3任一所述的治疗糖尿病足的间质干细胞制剂，其特征在于，所述将所述FT106-TSP4-GFP慢病毒表达质粒与所述慢病毒载体psPAX2和pMD.2G共转染293T细胞的步骤包括：
获取2.5M的CaCl2溶液，制备第一混合液，以所述第一混合液的质量百分比为100％计，所述第一混合液包括：10％～15％的所述2.5M的CaCl2溶液，0...

【专利技术属性】
技术研发人员：张倩，刘韬，
申请(专利权)人：深圳市罗湖区人民医院，
类型：发明
国别省市：广东;44