本发明专利技术公开了一种可用于高通量检测EB病毒中和实验结果的方法。所述方法主要以高内涵细胞成像仪作为检测仪器，对病毒感染细胞的感染效率或中和抗体及多抗血清的阻断病毒感染细胞的效率进行检测评估。为检测EB病毒的感染效率或评估中和抗体或多抗血清的中和能力提供了简便的高通量的检测方法，为临床样本的检测、EB病毒预防性疫苗的开发以及中和抗体的筛选提供基本的技术体系支持。
【技术实现步骤摘要】
一种高通量检测EB病毒感染效率/抗体阻断EB病毒感染效率的方法
本专利技术涉及生物医药
，更具体地说，涉及一种高通量检测EB病毒感染效率/抗体阻断EB病毒感染方法。
技术介绍
病毒性预防性疫苗研发过程中一项重要的考察指标就是针对候选疫苗所诱导的中和抗体应答进行检测，而中和抗体的效价评估以及临床血清的中和效价检测则主要依赖于高通量的检测方法，要求在较短的时间内一次性可检测较多的样本量，这就要求中和检测方法的高通量。现有技术主要包含两种，一种是依赖于EB病毒使淋巴细胞永生化实验的中和检测方法，该方法耗时比较久，实验周期约为四十天左右，不适合用于大规模临床血清的筛选和检测，主要通过利用细胞系生产的EB病毒感染人B细胞，EB病毒感染B细胞可以使B细胞发生永生化，因此可以借助B细胞永生化的转化效率来评价EB病毒的感染效率；另一种中和检测方法为基于流式细胞仪的检测方法，该方法不能对96孔板进行一次性读板检测，故无法满足高通量检测的要求，具体方法为在孔板中完成EB病毒感染细胞的实验流程，感染效率检测利用流式细胞仪对EB病毒的感染效率进行测定。
技术实现思路
本专利技术第一个方面的目的在于提供一种高通量检测EB病毒感染效率的方法。本专利技术第二个方面的目的，在于提供一种高通量检测多抗血清/抗体阻断EB病毒感染的效率的方法。本专利技术所采取的技术方案是：本专利技术的第一个方面，提供一种高通量检测EB病毒感染效率的方法，包括以下步骤：S1：制备EB病毒感染的待测细胞样品；S2：用高内涵检测仪器对待测细胞样品进行检测，并计算半数抑制浓度。优选地，根据本专利技术第一个方面所述的方法，步骤S1中所述待测细胞样品的制备方法为：在96孔板中用病毒液感染待测细胞样品，培养后待测。更优选地，根据本专利技术第一个方面所述的方法，步骤S1中所述待测细胞样品的制备方法为：在96孔板中用20μl病毒液感染104待测细胞样品，37℃二氧化碳培养箱感染120min后补充培养基至终体积为200μl，培养48小时后待测。根据本专利技术第一个方面所述的方法，步骤S2所述用高内涵检测仪器对待测细胞样品进行检测时选用GFP荧光检测模块。更具体地，根据本专利技术第一个方面所述的方法，所述GFP荧光检测模块的具体参数为：曝光时间80ms，曝光强度为50％，对焦高度为11μm。更具体地，根据本专利技术第一个方面所述的方法，步骤S2所述用高内涵检测仪器对待测细胞样品进行检测时，物镜选用20x空气镜。根据本专利技术第一个方面所述的方法，所述细胞待测样品放置于Nunc96细胞板中。本专利技术的第二个方面，提供一种高通量检测多抗血清/抗体阻断EB病毒感染的效率的方法，包括以下步骤：S1：将病毒液与按倍数梯度稀释的抗体分别混合，孵育；S2：于病毒液与抗体的混合液中加入等量的待测细胞样品，培养；S3：用高内涵检测仪器对待测细胞样品进行检测，根据样品稀释度及EB病毒感染效率计算半数抑制浓度。根据本专利技术第二个方面所述的方法，通过检测多抗血清/抗体对EB病毒的中和滴度，来衡量其阻断EB病毒感染的效率。根据本专利技术第二个方面所述的方法，步骤S1在96孔板中用将20μl病毒液与按倍数梯度稀释的抗体分别混合，孵育。根据本专利技术第二个方面所述的方法，步骤S2于病毒液与抗体的混合液中加入104待测细胞，37℃二氧化碳培养箱感染100～150min后补充培养基至终体积为200μl，培养48小时后待测。根据本专利技术第二个方面所述的方法，步骤S3中所述用高内涵检测仪器对待测细胞样品进行检测时选用GFP荧光检测模块。根据本专利技术第二个方面所述的方法，所述GFP荧光检测模块的具体参数为：曝光时间80ms，曝光强度为50％，对焦高度为11μm。根据本专利技术第二个方面所述的方法，在检测多抗血清的中和滴度时，先将血清以原倍浓度为起始梯度，按照10倍倍稀稀释8个梯度，然后在96孔板中分别与20μl病毒液孵育，37度二氧化碳培养箱孵育2小时后再加入104被感染细胞，再在37度二氧化碳培养箱感染2小时后补充培养基至终体积为200μl，培养48小时后待测。根据本专利技术第二个方面所述的方法，在检测单克隆抗体的中和滴度时，先将抗体以5mg/ml为起始梯度，按照5倍倍稀稀释8个梯度，然后在96孔板中分别与20μl病毒液孵育，37度二氧化碳培养箱孵育2小时后再加入104被感染细胞，再在37度二氧化碳培养箱感染2小时后补充培养基至终体积为200μl，培养48小时后待测。根据本专利技术第二个方面所述的方法，步骤S3所述用高内涵检测仪器对待测细胞样品进行检测时，物镜选用20x空气镜。根据本专利技术第二个方面所述的方法，所述细胞待测样品放置于Nunc96细胞板中。本专利技术的有益效果是：本专利技术利用特定的检测方法和实验体系实现了EB病毒感染效率测定、中和抗体中和效价测定和临床血清中和滴度测定的高通量检测。大大缩减了检测所需要的时间，减少了病毒和血清用量，提高了检测的效率，为EB病毒特异中和抗体筛选和疫苗免疫临床血清的中和效价评估提供了高通量的简便的检测方法。本专利技术同时通过现有EB病毒感染效率的流式细胞仪检测方法验证了本专利技术方法的准确性，在同一样品，同批次检测的结果来看，对两种方法检测得到的半数抑制浓度进行了相关性分析，其R2值为0.8942，分析结果显示两种方法的相关性较好。但采用高内涵检测仪器检测可一次性检测96个样品：而采用流式细胞仪需要一个流式管一个流式管的上样，而且还需要将样品转移到流式管中，不但耗时还非常浪费耗材，也由于检测方法的耗时，对于大批量检测容易产生较大的系统误差。本专利技术的专利技术人经过长时间的实践摸索，还提供了该方法实验阶段和检测阶段使用的细胞数和感染时使用的病毒体积的具体参数。附图说明图1为高内涵仪器检测十批次EB病毒的感染效率。图2为流式细胞仪检测十批次EB病毒的感染效率。图3为两种方法检测十批次EB病毒感染效率的相关性分析。A图为两种方法检测十批次EB病毒感染效率散点图；B图为两种方法的线性相关图。图4为高内涵仪器检测中和抗体72A1对不同感染效率EB病毒的中和阻断效率。图5为流式细胞仪检测中和抗体72A1对不同感染效率EB病毒的中和阻断效率。图6为两种方法检测中和抗体72A1对不同感染效率EB病毒的中和阻断效率的相关性分析。图7为高内涵仪器检测32份临床血清阻断EB病毒感染的中和效价。其中A图为第1～8份临床血清阻断EB病毒感染的中和效价；其中B图为第9～16份临床血清阻断EB病毒感染的中和效价；其中C图为第17～24份临床血清阻断EB病毒感染的中和效价；其中D图为第25～32份临床血清阻断EB病毒感染的中和效价。图8为流式细胞仪检测32份临床血清阻断EB病毒感染的中和效价。其中A图为第1～8份临床血清阻断EB病毒感染的中和效价；其中B图为第9～16份临床血清阻断EB病毒感染的本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种高通量检测EB病毒感染效率的方法，包括以下步骤：/nS1：制备EB病毒感染的待测细胞样品；/nS2：用高内涵检测仪器对待测细胞样品进行检测，并计算半数抑制浓度。/n
【技术特征摘要】
1.一种高通量检测EB病毒感染效率的方法，包括以下步骤：
S1：制备EB病毒感染的待测细胞样品；
S2：用高内涵检测仪器对待测细胞样品进行检测，并计算半数抑制浓度。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤S1中所述待测细胞样品的制备方法为：在96孔板中用病毒液感染待测细胞样品，培养后待测。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，步骤S1中所述待测细胞样品的制备方法为：在96孔板中用20μl病毒液感染104待测细胞样品，37℃二氧化碳培养箱感染120min后补充培养基至终体积为200μl，培养48小时后待测。
4.根据权利要求1至3任一项所述的方法，其特征在于，步骤S2所述用高内涵检测仪器对待测细胞样品进行检测时选用GFP荧光检测模块。
5.一种高通量检测多抗血清/抗体阻断EB病毒感染的效率的方法，包括以下步骤：
S1：将病毒液与按倍数梯度稀释的抗体分别混合，孵育；
S2：于病毒液与抗体的混合液中加入等量...
【专利技术属性】
技术研发人员：张晓，曾益新，曾木圣，徐淼，冯启胜，
申请(专利权)人：中山大学肿瘤防治中心中山大学附属肿瘤医院，中山大学肿瘤研究所，
类型：发明
国别省市：广东;44
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