一种催化活力提高的亮氨酸脱氢酶突变体及其应用制造技术

本发明专利技术公开了一种催化活力提高的亮氨酸脱氢酶突变体及其应用，属于酶工程和微生物工程技术领域。本发明专利技术提供了一种亮氨酸脱氢酶突变体，所述亮氨酸脱氢酶突变体与氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示的亮氨酸脱氢酶相比，进行了C端改造，切除C端残基364位精氨酸至374位甘氨酸，本发明专利技术首次对亮氨酸脱氢酶底物进出的通道进行改造，C端切除突变体可能扩大了底物的进出通道使得底物更易与蛋白结合，获得了更加高效制备L‑2‑氨基丁酸的亮氨酸脱氢酶。本发明专利技术提供的亮氨酸脱氢酶突变体△

【技术实现步骤摘要】
一种催化活力提高的亮氨酸脱氢酶突变体及其应用
本专利技术涉及一种催化活力提高的亮氨酸脱氢酶突变体及其应用，属于酶工程和微生物工程

技术介绍
L-2-氨基丁酸在食品、农业、生物医药等方面有着很大的应用价值，如它是用于治疗抗癫痫药物左已拉西坦、布瓦西坦的直接前体，也是用于合成治疗结核病的药物盐酸乙胺丁醇的重要手性前体。亮氨酸脱氢酶(leucinedehydrogenase,LeuDH，EC1.4.1.9)属于氧化还原酶家族，已被广泛用于非天然氨基酸的制备，如L-2-氨基丁酸(Tao,R.,Jiang,Y.,Zhu,F.etal.Aone-potsystemforproductionofL-2-aminobutyricacidfromL-threoninebyL-threoninedeaminaseandaNADH-regenerationsystembasedonL-leucinedehydrogenaseandformatedehydrogenase.BiotechnolLett36,835–841(2014))，L-叔亮氨酸(LiJ,PanJ,ZhangJ,etal.StereoselectivesynthesisofL-tert-leucinebyanewlyclonedleucinedehydrogenasefromExiguobacteriumsibiricum[J].JournalofMolecularCatalysisBEnzymatic,2014,105(7):11-17)等；并且已有较多文献对亮氨酸脱氢酶偶联辅酶循环及苏氨酸脱氨酶的一锅法制备进行研究优化，但是，在其制备非天然氨基酸如L-2-氨基丁酸的过程中由于亮氨酸脱氢酶催化活力低于苏氨酸脱氨酶，导致中间产物不断积累不断抑制亮氨酸脱氢酶的活性，致使亮氨酸脱氢酶不足以催化不断产生的中间产物2-酮丁酸，因此急需一种催化活力高的亮氨酸脱氢酶。
技术实现思路
为解决上述技术问题，本专利技术提供了一种亮氨酸脱氢酶突变体，所述亮氨酸脱氢酶突变体与氨基酸序列如SEQIDNO.1所示的亮氨酸脱氢酶相比，切除了C端残基364位精氨酸至374位甘氨酸。在本专利技术的一种实施方式中，编码所述亮氨酸脱氢酶突变体的核苷酸序列如SEQIDNO.2所示。在本专利技术的一种实施方式中，所述亮氨酸脱氢酶来源于Exiguobacteriumsibiricum。本专利技术还提供了携带上述基因的载体。在本专利技术的一种实施方式中，所述载体包括质粒、噬菌体或病毒载体。在本专利技术的一种实施方式中，所述载体为pET-28a质粒。本专利技术还提供了携带上述基因或上述载体的宿主细胞。在本专利技术的一种实施方式中，所述宿主细胞为细菌或真菌。在本专利技术的一种实施方式中，所述宿主细胞为E.coliBL21(DE3)、E.coliJM109、E.coliDH5α。本专利技术还提供了上述亮氨酸脱氢酶突变体的制备方法，所述方法为将上述宿主细胞接入到培养基中进行发酵，发酵结束后，收集菌液，将菌液离心后收集菌体，将菌体重悬后进行破碎，将细胞破碎液离心后收集上清，从上清液中分离得到亮氨酸脱氢酶突变体。在本专利技术的一种实施方式中，将上述宿主细胞的种子液按照1-5％接种量接入到LB液体培养基中，于35-39℃，200-220r/min培养至菌密度OD达到0.5-0.8后，加入IPTG诱导剂于16-25℃，诱导10-14h后收集菌液，将菌液离心后收集菌体，将菌体重悬后破碎菌体，将细胞破碎液离心后收集上清，从上清液中分离得到亮氨酸脱氢酶突变体。本专利技术还提供了应用上述方法制备得到的亮氨酸脱氢酶突变体。本专利技术还提供了上述亮氨酸脱氢酶突变体或上述基因或上述载体或上述宿主细胞或上述制备方法在制备L-2-氨基丁酸或含L-2-氨基丁酸的产品中的应用。本专利技术还提供了一种制备L-2-氨基丁酸的方法，以上述亮氨酸脱氢酶突变体或上述宿主细胞为催化剂，以2-酮丁酸为底物，催化制备L-2-氨基丁酸。[有益效果](1)本专利技术提供了一种催化活力提高的亮氨酸脱氢酶突变体，本专利技术通过对C端进行了改造，切除C端残基364位精氨酸至374位甘氨酸，得到了亮氨酸脱氢酶突变体△364-374，亮氨酸脱氢酶突变体△364-374的比酶活为201U/mg，相对于野生酶提高了20％。(2)本专利技术首次对亮氨酸脱氢酶底物进出的通道进行改造，C端切除突变体可能扩大了底物的进出通道使得底物更易与蛋白结合，获得了更加高效制备L-2-氨基丁酸的亮氨酸脱氢酶。附图说明图1：△364-374、△369-374、△373-374突变体SDS-PAGE分析；其中M：marker；C:BL21/28a破碎上清对照；1：BL21/28a-EsLDH-△364-374上清；2：BL21/28a-EsLDH-△364-374沉淀；3：BL21/28a-EsLDH-△369-374上清；4：BL21/28a-EsLDH-△369-374沉淀；5：BL21/28a-EsLDH-△373-374上清；6：BL21/28a-EsLDH-△373-374沉淀。图2：突变体△364-374、△369-374、△373-374纯化样品SDS-PAGE分析；其中，M：marker；1：BL21/28a-EsLDH-△373-374样品1；2：BL21/28a-EsLDH-△373-374样品2；3：BL21/28a-EsLDH-△369-374样品1；4：BL21/28a-EsLDH-△369-374样品2；5：BL21/28a-EsLDH-△364-374样品1；6：BL21/28a-EsLDH-△364-374样品2。具体实施方式下面结合具体实施例，对本专利技术进行进一步的阐述。下述实施例中涉及的大肠杆菌E.coliBL21(DE3)购自北纳生物，pET-28a(+)质粒购自Novagen公司；下述实施例中涉及的PBS缓冲液粉末、2-酮丁酸、L-2-氨基丁酸、β-NADH购自上海阿拉丁生化科技股份有限公司。下述实施例中涉及的培养基如下：LB液体培养基：蛋白胨10g/L、酵母膏5g/L、NaCl10g/L。LB固体培养基：蛋白胨10g/L、酵母膏5g/L、NaCl10g/L、琼脂粉1.5％(m/v)。下述实施例中涉及的检测方法如下：亮氨酸脱氢酶酶活的测定方法：在浓度为900mM氯化铵-氨水缓冲液(pH9.5)中加入0.3mg/mLNADH、0.75mg/mL底物2-酮丁酸，获得反应体系；在1600μl反应体系中加入2μL酶液启动反应，30℃反应3分钟，每隔30s测定340nm吸光度的值并记录数据，根据1min内反应液在340nm吸光值差值，计算出亮氨酸脱氢酶酶活；其中，亮氨酸脱氢酶酶活(U/mL)＝吸光度变化值反应总体系(μL)/(酶液量(μL)×摩尔消光系数(6.22×10-3mol/(L.cm-2)×比色光径)。本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种亮氨酸脱氢酶突变体，所述亮氨酸脱氢酶突变体与氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的亮氨酸脱氢酶相比，切除了C端残基364位精氨酸至374位甘氨酸。/n

【技术特征摘要】
1.一种亮氨酸脱氢酶突变体，所述亮氨酸脱氢酶突变体与氨基酸序列如SEQIDNO.1所示的亮氨酸脱氢酶相比，切除了C端残基364位精氨酸至374位甘氨酸。


2.如权利要求1所述的一种亮氨酸脱氢酶突变体，其特征在于，编码所述亮氨酸脱氢酶突变体的核苷酸序列如SEQIDNO.2所示。


3.编码权利要求1所述的亮氨酸脱氢酶突变体的基因。


4.携带权利要求3所述基因的载体。


5.如权利要求4所述的载体，其特征在于，所述载体为pET-28a质粒。


6.携带权利要求3所述的基因或权利要求4或5所述载体的宿主细胞。


7.如权利要求6所述的宿主细胞，其特征在于，所述宿主细胞为细菌...

【专利技术属性】
技术研发人员：饶志明，徐美娟，陈佳杰，张显，杨套伟，邵明龙，
申请(专利权)人：江南大学，
类型：发明
国别省市：江苏;32