一种从葡萄皮渣或鲜果果皮中提取分离14种花色苷单体的方法技术

本发明专利技术涉及植物源花色苷的提取、纯化、分离以及生产领域，特别涉及一种从葡萄皮渣或鲜果果皮中提取分离14种花色苷单体的方法。该方法包括如下步骤：将葡萄皮渣或鲜果果皮速冻，研磨成粉；将粉末与酸化甲醇混合，并采用超声波辅助提取，得到过滤液；将过滤液浓缩，回收甲醇，将所得粗提物溶于酸化水中，得到粗提物水溶液；粗提物水溶液经过微孔滤膜过滤、超声波脱气处理后，采用大孔吸附树脂进行纯化；采用半制备高效液相色谱对花色苷提取物进行分离，得到14种花色苷单体。本发明专利技术通过半制备高效液相色谱在40min内实现了14种花色苷的制备，分离效果优，制备速度快，不需进行多次分离。

【技术实现步骤摘要】
一种从葡萄皮渣或鲜果果皮中提取分离14种花色苷单体的方法
本专利技术涉及植物源花色苷的提取、纯化、分离以及生产领域，特别涉及一种从葡萄皮渣或鲜果果皮中提取分离14种花色苷单体的方法。
技术介绍
花色苷作为植物的次生代谢产物广泛存在于自然界中，是一种安全的天然色素，并且具有显著的抗氧化能力，已有很多研究表明花色苷具有卓越的营养活性功能，对许多疾病都有预防甚至治疗的作用。葡萄是全世界最重要的水果之一，截至2017年，其在全球范围内的种植面积达到了760万公顷，其中一半以上被用来酿造葡萄酒。在葡萄酒的生产过程中会产生大量的葡萄皮渣废物(约占葡萄起始重量的20％—30％)，每年有近九百万吨的葡萄皮渣在全球各地的酒厂中产生。在这些皮渣中仍然残留着丰富的多酚物质，其中花色苷的含量十分可观，但在酒厂中，绝大部分葡萄皮渣都以废弃物的形式被处理掉，不仅耗费了巨大的处理成本，增加了酒厂的负担，同时也是对自然资源的一种浪费，处理不当还有可能对环境产生负面的影响。葡萄酒酿造时产生的皮渣废弃物却可以作为制备花色苷的良好原料。一般来说，单体花色苷纯品的制备都需要经过提取、纯化以及分离的过程。目前植物中花色苷的提取方法主要有溶剂法、酶法、发酵法、超临界萃取等，纯化可以采用柱层析(大孔吸附树脂、离子交换树脂、凝胶柱等)、膜分离、重结晶等技术，而对于含有复杂种类花色苷的葡萄来说，往往需要借助高效液相色谱才能实现对不同花色苷单体的分离制备。已有许多针对不同植物来源花色苷的制备技术，比如蓝莓、桑葚、紫薯、黑果枸杞等，然而，当前的花色苷制备技术大多采用溶剂浸提，耗时较长，效果不佳，还易造成花色苷的降解。此外，由于葡萄中花色苷种类的多样性，目前许多分离技术使用多个层析柱、色谱柱相结合的技术，或者在同一色谱柱上采用多次进样和不同的液相洗脱模式，逐步实现不同花色苷单体的分离，操作复杂且耗时，成本较高。此外，尽管自然界中花色苷的种类繁多，在全球范围内市售花色苷标准品的种类却十分稀少，这在很大程度上成为了阻碍花色苷领域相关研究进一步深入的屏障。
技术实现思路
有鉴于此，本专利技术提供了一种从葡萄皮渣或鲜果果皮中提取分离14种花色苷单体的方法。该方法通过半制备高效液相色谱在40min内实现了14种花色苷的制备，分离效果优，制备速度快，不需进行多次分离。为了实现上述专利技术目的，本专利技术提供以下技术方案：本专利技术提供了一种从葡萄皮渣或鲜果果皮中提取分离14种花色苷单体的方法，包括如下步骤：将葡萄皮渣或鲜果果皮速冻，研磨成粉；将粉末与酸化甲醇混合，并采用超声波辅助提取，得到过滤液；将过滤液浓缩，回收甲醇，将所得粗提物溶于酸化水中，得到粗提物水溶液；粗提物水溶液经过微孔滤膜过滤、超声波脱气处理后，采用大孔吸附树脂进行纯化，纯化为：将粗提物水溶液加样于大孔吸附树脂，先用酸化水洗脱除杂，再用酸化甲醇洗脱，收集洗脱液，浓缩，过滤，得到花色苷提取物；采用半制备高效液相色谱对花色苷提取物进行分离，得到14种花色苷单体；半制备高效液相色谱的条件为：流动相A为水、甲酸和乙腈的混合液，流动相A中水、甲酸与乙腈的体积比为(90～94)：(1～3)：(5～7)；流动相B为水、甲酸和乙腈的混合液，流动相B中水、甲酸与乙腈的体积比为(42～46)：(1～3)：(53～55)；梯度洗脱程序。本专利技术的目的在于从欧亚种葡萄皮渣中制备多种高纯度的花色苷单体，一方面是对葡萄酒产业中废弃物的再利用，实现变废为宝，可以减轻酒厂的成本甚至为酒厂额外创收；另一方面通过本法可以制备出葡萄中存在的主要花色苷，其纯度高达90％以上，并且操作过程简单易行，制备出的高纯度花色苷可用于其呈色机制以及生理活性等方面的研究，一定程度上弥补了市场上花色苷纯品种类单一的缺陷，也为大规模生产提供了技术上的借鉴。在本专利技术中，14种花色苷单体为：花翠素-3-O-葡萄糖苷Dp-G、花青素-3-O-葡萄糖苷Cy-G、甲基花翠素-3-O-葡萄糖苷Pt-G、甲基花青素-3-O-葡萄糖苷Pn-G、二甲基花翠素-3-O-葡萄糖苷Mv-G、甲基花翠素-3-O-(6-O-乙酰化)-葡萄糖苷Pt-AG、花翠素-3-O-(反式-6-O-p-香豆酰化)-葡萄糖苷Dp-CouG(t)、甲基花青素-3-O-(6-O-乙酰化)-葡萄糖苷Pn-AG、二甲基花翠素-3-O-(6-O-乙酰化)-葡萄糖苷Mv-AG、二甲基花翠素-3-O-(6-O-p-咖啡酰化)-葡萄糖苷Mv-CafG、甲基花翠素-3-O-(反式-6-O-p-香豆酰化)-葡萄糖苷Pt-CouG(t)、二甲基花翠素-3-O-(顺式-6-O-p-香豆酰化)-葡萄糖苷Mv-CouG(c)、甲基花青素-3-O-(反式-6-O-p-香豆酰化)-葡萄糖苷Pn-CouG(t)、二甲基花翠素-3-O-(反式-6-O-p-香豆酰化)-葡萄糖苷Mv-CouG(t)。作为优选，以g/mL计，粉末与酸化甲醇的比例为1：(8～12)。优选地，以g/mL计，粉末与酸化甲醇的比例为1：10。作为优选，酸化甲醇为含有体积百分含量为2％～4％甲酸的甲醇。优选地，酸化甲醇为含有体积百分含量为3％甲酸的甲醇。作为优选，超声波辅助提取的温度为10～35℃，提取的时间为5～15min，提取的次数为2～4次。优选地，超声波辅助提取的温度为35℃，提取的时间为10min，提取的次数为3次。作为优选，浓缩的温度为33～37℃。优选地，浓缩的温度为35℃。作为优选，酸化水为含有体积百分含量为2％～4％甲酸的水。优选地，酸化水为含有体积百分含量为3％甲酸的水。作为优选，大孔吸附树脂为大孔吸附树脂XAD-7HP。作为优选，微孔滤膜的孔径为0.4～0.5μm的聚四氟乙烯微孔滤膜。优选地，微孔滤膜的孔径为0.45μm的聚四氟乙烯微孔滤膜。作为优选，在大孔吸附树脂进行纯化的步骤中，酸化水的用量为2.5～3.5倍柱体积，流速为2.5～3.5BV/h。作为优选，酸化甲醇的流速为2.5～3.5BV/h。优选地，在大孔吸附树脂进行纯化的步骤中，酸化水的用量为3倍柱体积，流速为3BV/h。优选地，酸化甲醇的流速为3BV/h。作为优选，流动相A中水、甲酸与乙腈的体积比为92：2：6；流动相B中水、甲酸与乙腈的体积比为44：2：54。作为优选，梯度洗脱程序为：0min-18min，10％-25％B；18min-20min，25％B；20min-30min，25％-40％B；30min-35min，40％-70％B；35min-40min，70％-100％B，用A相补足100％。作为优选，半制备高效液相色谱的流速为0.8～1.2mL/min；柱温为48～52℃；检测波长为520～530nm。优选地，半制备高效液相色谱的流速为1.0mL/min；柱温为50℃；检测波长为525nm。作为优选，半制备高效液相色谱的色谱柱为安捷伦ZorbaxSB-C18，型号本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种从葡萄皮渣或鲜果果皮中提取分离14种花色苷单体的方法，其特征在于，包括如下步骤：/n将葡萄皮渣或鲜果果皮速冻，研磨成粉；将粉末与酸化甲醇混合，并采用超声波辅助提取，得到过滤液；/n将过滤液浓缩，回收甲醇，将所得粗提物溶于酸化水中，得到粗提物水溶液；/n粗提物水溶液经过微孔滤膜过滤、超声波脱气处理后，采用大孔吸附树脂进行纯化，所述纯化为：将粗提物水溶液加样于大孔吸附树脂，先用酸化水洗脱除杂，再用酸化甲醇洗脱，收集洗脱液，浓缩，过滤，得到花色苷提取物；/n采用半制备高效液相色谱对所述花色苷提取物进行分离，得到14种花色苷单体；所述半制备高效液相色谱的条件为：流动相A为水、甲酸和乙腈的混合液，流动相A中水、甲酸与乙腈的体积比为(90～94)：(1～3)：(5～7)；流动相B为水、甲酸和乙腈的混合液，流动相B中水、甲酸与乙腈的体积比为(42～46)：(1～3)：(53～55)；梯度洗脱程序。/n

【技术特征摘要】
1.一种从葡萄皮渣或鲜果果皮中提取分离14种花色苷单体的方法，其特征在于，包括如下步骤：
将葡萄皮渣或鲜果果皮速冻，研磨成粉；将粉末与酸化甲醇混合，并采用超声波辅助提取，得到过滤液；
将过滤液浓缩，回收甲醇，将所得粗提物溶于酸化水中，得到粗提物水溶液；
粗提物水溶液经过微孔滤膜过滤、超声波脱气处理后，采用大孔吸附树脂进行纯化，所述纯化为：将粗提物水溶液加样于大孔吸附树脂，先用酸化水洗脱除杂，再用酸化甲醇洗脱，收集洗脱液，浓缩，过滤，得到花色苷提取物；
采用半制备高效液相色谱对所述花色苷提取物进行分离，得到14种花色苷单体；所述半制备高效液相色谱的条件为：流动相A为水、甲酸和乙腈的混合液，流动相A中水、甲酸与乙腈的体积比为(90～94)：(1～3)：(5～7)；流动相B为水、甲酸和乙腈的混合液，流动相B中水、甲酸与乙腈的体积比为(42～46)：(1～3)：(53～55)；梯度洗脱程序。


2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，以g/mL计，所述粉末与所述酸化甲醇的比例为1：(8～12)。


3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述酸化甲醇为含有体积百分含量为2％～4％甲酸的甲醇。


4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述超声波辅助提取的温度为10～35℃，提取的时间为5～15min，提取的次数为2～4次。

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【专利技术属性】
技术研发人员：何非，赵旭，张珊珊，段长青，
申请(专利权)人：中国农业大学，
类型：发明
国别省市：北京;11