测量含于样品中的内毒素或(1→3)-β-D葡聚糖的方法及其试剂技术

一种测量含于样品中的内毒素或（１→３）－β－Ｄ－葡聚糖（以后称作β－葡聚糖）的方法，包括将样品在至少一种选自聚乙二醇，聚乙烯醇，甲基纤维素和羟丙基纤维素的水溶性聚合物存在下与马蹄蟹的变形细胞溶胞产物混合，用光照射得到的混合物，测量直到样品与变形细胞溶胞产物混合后，或样品与变形细胞溶胞产物混合经过预定时间之后，产生的混合物的光学变化程度达到一个预定值所需的时间，以该时间与内毒素或β－葡聚糖的量之间的关系为基础测定含于样品中的内毒素或β－葡聚糖的含量。（*该技术在2015年保护过期，可自由使用*）

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】
本专利技术涉及测定包含于样品中的内毒素或(13)-β-D-葡聚糖(以下称作β-葡聚糖)的量的方法，包括将内毒素或β-葡聚糖与马蹄蟹的变形细胞溶胞产物反应，并用动力学比浊法分析反应混合物。内毒素是存在于革兰氏阴性菌细胞壁内的物质，并具有诸如发热等多种生物活性。因而，当直接与药品或血液接触的医疗器械被内毒素污染时，尽管在内毒素的量很低的情况下也会带来严重后果。因此，内毒素污染应严格控制。同样地，对于归因于革兰氏阴性菌的败血症的早期诊断，也要检测内毒素在血液中的含量。而且，β-葡聚糖是已知存在为酵母和霉菌细胞壁的骨胳组成，为许多担子菌纲子实体(磨菇)的重要聚糖成份，为从用于血液透析等的膜的洗出成份。β-葡聚糖的生物活性不象内毒素情况下那样清楚；然而，真菌病的早期诊断和医疗器械被真菌污染的检测通过测量β-葡聚糖而成为可能。这已经被考虑到。每种内毒素和葡聚糖已知与含有马蹄蟹的变形细胞溶胞产物的溶液(以下称作AL溶液)反应以激活一种酶并引起凝胶反应。利用这类性质，测量含于样品中的内毒素或β-葡聚糖的多种方法被发展和应用。利用在AL溶液和内毒素(或β-葡聚糖)之间发生的凝胶化反应的测量方法的代表性例子包括所谓的胶凝法，其中目测确定是否发生胶凝化，和所谓的动力学比浊法，如用于测定含于样品中的内毒素(或β-葡聚糖)的量的方法，以内毒素(或β-葡聚糖)浓度和凝胶化时间之间的关系为基础，该时间通过测量透光度比(Rt)，(这一比值被凝胶化反应降低)的变化程度或比值Rt的对数值的改变程度达到预期值所需的时间而确定。由内毒素(β-葡聚糖)浓度和开始时间之间的关系测定样品中内毒素(或β-葡聚糖)的含量的方法，开始时间通过测量直到归因于凝胶化反应的透光或吸光的变化的改变程度达到预定值的需要时间而确定，等等。在这些方法中，动力学比浊法与胶凝法相比更简单且具有更高的灵敏度因而被广泛使用。然而，最近的动力学比浊法的内毒素检测极限通常为约0.001EU/ml，因而，需要一种能使更低得多的内毒素被检测到的高灵敏度的测定方法。另一方面，US-4221865公开了测定内毒素的方法，它改进了测量灵敏度，并通过在AL溶液和内毒素(或β-葡聚糖)反应期间存在离子型表面活性剂和悬浮剂或同时存在具有两者性质的聚合物而加强浊度测定法的重现性。根据这一美国专利，加入离子型表面活性剂以停止Limulus蛋白的凝聚，而加入悬浮剂以稳定药物或食物乳胶和胶态溶液。然而，这一方法必须使用表面活性剂和悬浮剂两种试剂，这就有这样的问题，即操作变复杂且AL溶液被存在于试剂中的内毒素或β-葡聚糖污染的可能性增加。因此，即使现在也需要进一步改进。本专利技术的目的在于提供一种通过动力学比浊法测量含于样品中的内毒素和β-葡聚糖的方法，这一方法具有非常高的灵敏度，与常规方法相比，更低含量的内毒素或β-葡聚糖可被检测到。以下详述本专利技术的其它目的和优点。根据本专利技术，提供了一种测量含于样品中的内毒素或β-葡聚糖的方法，包括将含内毒素或β-葡聚糖的样品在至少一种选自聚乙二醇，聚乙烯醇，甲基纤维素和羟丙基纤维素的水溶性聚合物的存在下与马蹄蟹的变形细胞溶胞产物混合。用光照射得到的液体混合物，测量直到液体混合物的光学变化程度达到一个预定值所需的时间，这是在样品与变形细胞溶胞产物混合之后，或从样品与变形细胞溶胞产物混合开始经过预定的时间后进行的，和基于所说的时间与内毒素或β-葡聚糖之间的关系测定含于样品中的内毒素或β-葡聚糖的量。本专利技术还提供用于测定样品中的内毒素或β-葡聚糖含量的试剂，包括马蹄蟹的变形细胞溶胞产物和至少一种选自聚乙二醇，聚乙烯醇，甲基纤维素和羟丙基纤维素。在所谓动力学比浊法中，例如基于内毒素(或β-葡聚糖)浓度和凝胶化时间之间的关系来测定含于样品中的内毒素(或β-葡聚糖)的含量的方法，凝胶化时间通过测量直到透光量比Rt的变化程度或比值Rt的对数值的变化程度，(该比值被作为AL溶液和内毒素(或β-葡聚糖)之间反应结果的凝胶化反应所降低)达到一个预定值所需的时间而确定；由内毒素(β-葡聚糖)浓度和开始时间之间关系测定含于样品中的内毒素(或β-葡聚糖)含量的方法，开始时间通过测量直到归因于凝胶化反应的透光度或吸光度的变化达到一个预定值所需的时间而确定；等等，凝胶化反应可通过在AL溶液与内毒素(或β-葡聚糖)反应期间在反应体系中特定的水溶性聚合物存在而不共用离子型表面活性剂而有效地加速。换句话说，缩短动力学比浊法中的反应时间和加强动力学比浊法的测量灵敏度两者均通过只使用特定的水溶性聚合物而不用离子型表面活性剂而实现。如前面提到的，离子型表面活性剂根本不被用于本专利技术中。因为离子型表面活剂具有，例如，停止马蹄蟹变形细胞溶胞产物和内毒素(β-葡聚糖)之间反应的功能，在AL溶液中沉淀一个成分(不是由与内毒素或β-葡聚糖反应产生的凝胶)的功能，等等，当离子型表面活性剂以常用量(例如在US-4221865中指出的，在溶液中浓度为0.5至20％重量)使用时，根据本专利技术在动力学比浊法中灵敏度的改进(换句话说，由于反应时间缩短而使测量灵敏度的改进)则不能获得。在用于本专利技术的特定水溶性聚合物中，聚乙二醇优选地具有重量平均分子量3000至4000000，更优选地7500至70000。当重量平均分子量太小时，凝胶化加速作用很弱，而当其太大时，含有聚乙二醇的溶液的粘度变得太高故其处理变得困难。如上相同的原因，聚乙烯醇优选地具有聚合度500至2000。用于作为内毒素(或β-葡聚糖)与AL溶液反应结果的凝胶化反应中的特定水溶性聚合物的浓度(以下称作用于凝胶化反应中的浓度)在某种程度上根据所用的水溶性聚合物的类别，分子量，聚合度等，和所用AL溶液的类别和份量而变化；然而，当例如具有重量平均分子量约3000的聚乙二醇被使用时，适当地选自0.5至4W/W％的范围；当用具有重量平均分子量约7500的聚乙二醇时，范围为0.3至4W/W％；当用具有重量平均分子量20000至70000的聚乙二醇时，范围为0.3至1.5W/W％；当用具有重量平均分子量500000至4000000的聚乙二醇时，范围为0.2至0.5W/W％。而且，当使用聚合度约500的聚乙烯醇时，凝胶化反应中所用的浓度适当地选自1至3W/W％的范围；当用具有聚合度约2000的聚乙烯醇时，范围为0.2至1W/W％；当用具有粘度约15CPS的甲基纤维素时，范围为0.2至1W/W％；当用具有粘度约100CPS的甲基纤维素时，范围为0.1至1W/W％；或当用羟丙基纤维素时，范围为0.1至1W/W％。这些水溶性聚合物即使各自单独使用也具有足够的效果；然而，它们将以两种或更多的适当组合被应用。用于本专利技术的水溶性聚合物理所当然地必须不含有足以影响测量含于样品中的内毒素或β-葡聚糖含量的内毒素或β-葡聚糖。为此目的，选用具有微量内毒素或β-葡聚糖含量的水溶性聚合物，或者，当所用的水溶性聚合物含有明显量的内毒素和β-葡聚糖时，水溶性聚合物需要用高压釜或内毒素吸收剂等预先除去内毒素和β-葡聚糖。当内毒素和β-葡聚糖的除去用高压灭菌器进行时，它足以，例如，使上述水溶性聚合物形成具有合适聚合物浓度的溶液，然后使其在高压灭菌器内在，例如，在常用湿度(约121℃)下处理约15至120本文档来自技高网...

【技术保护点】
测量含于样品中的内毒素或（１→３）－β－Ｄ－葡聚糖的方法，包括：将样品在至少一种选自聚乙二醇，聚乙烯醇，甲基纤维素和羟丙基纤维的水溶性聚合物存在下与马蹄蟹的变形细胞溶胞产物混合，用光照射得到的液体混合物，测量在样品与变形细胞溶胞 产物混合后，或样品与变形细胞溶胞产物混合后经过预定的时间之后，直到产生的液体混合物的光学变化程度达到一个预定值所需的时间，和以该时间与内毒素或（１→３）－β－Ｄ－葡聚糖的量之间的关系为基础测定含于样品中的内毒素或（１→３）－β－Ｄ－葡聚 糖的含量。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】...

【专利技术属性】
技术研发人员：高冈文，土谷正和，川边惠子，井尻晴久，
申请(专利权)人：和光纯药工业株式会社，
类型：发明
国别省市：JP[日本]