C-糖基转移酶及其在合成夏佛塔苷和异夏佛塔苷中的应用制造技术

本发明专利技术公开了一种C‑糖基转移酶及其在合成夏佛塔苷和异夏佛塔苷中的应用。本发明专利技术从黄芩、玉米、水稻、甘草、大薸、少根紫萍、一把伞南星中分离获得了2‑羟基黄烷酮C‑糖基转移酶基因(SbCGTa、GuCGTa、PsCGTa、LpCGTa、AeCGTa)和C‑葡萄糖‑2‑羟基黄烷酮C‑糖基转移酶基因(SbCGTb、ZmCGTb、OsCGTb1、OsCGTb2、GuCGTb、PsCGTb、LpCGTb、AeCGTb)，首次发现这些基因编码的蛋白参与合成植物中植保素夏佛塔苷和异夏佛塔苷，从而为体外利用酶催化方法合成夏佛塔苷、异夏佛塔苷及其类似物提供了可行的方法。

【技术实现步骤摘要】
C-糖基转移酶及其在合成夏佛塔苷和异夏佛塔苷中的应用
本专利技术涉及分子生物学领域，尤其涉及C-糖基转移酶(CGT)基因及其编码蛋白和在合成夏佛塔苷和异夏佛塔苷中的应用。
技术介绍
夏佛塔苷和异夏佛塔苷是一类具有不同糖基的黄酮双碳苷，作为植保素，在多种植物中均有分布。目前在19个科39种植物中含有该类成分，包括水生和陆生植物、单子叶和双子叶植物、以及草木和灌木植物中1。夏佛塔苷和异夏佛塔苷具有明显的生理学活性和药理学活性。在金线草中，夏佛塔苷作为异感化物，可抑制独脚金生长2a-c。在水稻的韧皮部中，夏佛塔苷作为拒食剂。青蒿块茎中的夏佛塔苷和异夏佛塔苷具有杀线虫活性。此外，夏佛塔苷和异夏佛塔苷也具有多种药理活性。芋头、硬核属植物(Scleropyrumpentandrum)、甘蔗糖蜜和黄芩中的夏佛塔苷和异夏佛塔苷表现出抗氧化活性3a-d。金钱草中的夏佛塔苷作为血管紧张素转化酶抑制剂表现出抗高血压功能4。合果芋中的异夏佛塔苷通过降低肾Na+,K+-ATP酶活性表现出抗高血压活性5。闭鞘姜属植物(Costusspiralis)叶中的夏佛塔苷和异夏佛塔苷通过抑制α-糖苷酶表现出抗糖尿病功能6。麻风树叶中的异夏佛塔苷对A375细胞表现出抗恶性细胞增生的活性7。异叶杜鹃和牛筋草中的夏佛塔苷具有抗肝毒性和抑制LPS诱导的小鼠肺炎活性8a-b。然而，夏佛塔苷和异夏佛塔苷在植物中的生物合成过程却不清楚。近年来，关于植物中黄酮碳苷的生物合成途径也有报道，主要有三种：1)水稻中C-糖基转移酶(OsCGT)催化2-羟基黄烷酮生成C-葡萄糖-2-羟基黄烷酮，经脱水酶选择性催化生成黄酮-6-C-葡萄糖，如异牡荆苷和异荭草素9。此外，玉米中C-糖基转移酶(UGT708A6)10、荞麦中C-糖基转移酶(FeCGTa和FeCGTb)11、大豆中C-糖基转移酶(UGT708D1)12的催化功能与OsCGT的催化功能相似。以上C-糖基转移酶除了催化功能相似，在氨基酸序列上也有一定的相似性，均含有DPFF保守区。2)龙胆中C-糖基转移酶(GtUF6CGT1)直接催化芹菜素生成异牡荆苷，这是一种直接在黄酮母核上催化生成黄酮单葡萄糖碳苷的反应13。GtUF6CGT1选择性在黄酮C-6位进行碳苷化反应。相似的，葛根中C-糖基转移酶(PlUGT43)直接催化大豆素生成葛根素14。PlUGT43选择性在异黄酮的C-8位进行碳苷化反应。3)对于黄酮双葡萄糖碳苷的生物合成，仅发现橘属中2个C-糖基转移酶(FcCGT和CuCGT)15。FcCGT和CuCGT先催化2-羟基黄烷酮生成C-葡萄糖-2-羟基黄烷酮，再进一步催化生成2C-葡萄糖-2-羟基黄烷酮，脱水产生新西兰牡荆苷。FcCGT和CuCGT与大部分植物中的C-糖基转移酶相似，也具有DPFF保守区。然而，具有不同糖基的黄酮双碳苷，如夏佛塔苷和异夏佛塔苷的生物合成过程尚不清楚。因此，阐明植物中植保素夏佛塔苷和异夏佛塔苷的生物合成过程具有重要的意义。
技术实现思路
本专利技术的目的在于阐明夏佛塔苷和异夏佛塔苷的生物合成过程，并建立了体外酶法合成夏佛塔苷、异夏佛塔苷及其类似物的方法。为实现上述技术目的，本专利技术通过转录组分析的方法，从黄芩(Scutellariabaicalensis)、玉米(Zeamays)、水稻(Oryzasativa)、甘草(Glycyrrhizauralensis)、大薸(Pistiastratiotes)、少根紫萍(Landoltiapunctate)、一把伞南星(Arisaemaerubescens)七种植物中筛选出可能的C-糖基转移酶基因序列。首先，采用RT-PCR的方法扩增可能的C-糖基转移酶基因，经改良的quick-change法或无缝拼接的方法构建重组载体，并在大肠杆菌中表达，经纯化后获得相应的C-糖基转移酶蛋白。通过功能表征，在黄芩、玉米、水稻、甘草、大薸、少根紫萍、一把伞南星中共发现13个C-糖基转移酶，即五个2-羟基黄烷酮C-糖基转移酶(SbCGTa、GuCGTa、PsCGTa、LpCGTa、AeCGTa)和八个C-葡萄糖-2-羟基黄烷酮C-糖基转移酶(SbCGTb、ZmCGTb、OsCGTb1、OsCGTb2、GuCGTb、PsCGTb、LpCGTb、AeCGTb)。从黄芩、玉米、水稻、甘草、大薸、少根紫萍、一把伞南星中分离获得的五种2-羟基黄烷酮C-糖基转移酶基因分别命名为SbCGTa、GuCGTa、PsCGTa、LpCGTa、AeCGTa，它们的核苷酸序列分别如序列表中SEQIDNo：1、5、11、9和7所示；八种C-葡萄糖-2-羟基黄烷酮C-糖基转移酶基因分别命名为SbCGTb、ZmCGTb、OsCGTb1、OsCGTb2、GuCGTb、PsCGTb、LpCGTb和AeCGTb，其核苷酸序列分别如序列表中SEQIDNo：2、13、3、4、6、12、10和8所示。含有上述2-羟基黄烷酮C-糖基转移酶基因或C-葡萄糖-2-羟基黄烷酮C-糖基转移酶基因的载体、表达盒、宿主菌和转基因细胞系也在本专利技术的保护范围内。上述2-羟基黄烷酮C-糖基转移酶基因编码的蛋白SbCGTa、GuCGTa、AeCGTa、LpCGTa、和PsCGTa的氨基酸序列分别如序列表中SEQIDNo：14、18、20、22和24所示。上述C-葡萄糖-2-羟基黄烷酮C-糖基转移酶基因编码的蛋白ZmCGTb、OsCGTb1、OsCGTb2、SbCGTb、GuCGTb、AeCGTb、LpCGTb、PsCGTb的氨基酸序列分别如序列表中SEQIDNo：26、16、17、15、19、21、23和25所示。本专利技术发现，上述C-糖基转移酶参与植物中植保素夏佛塔苷和异夏佛塔苷的生物合成过程。利用上述2-羟基黄烷酮C-糖基转移酶和C-葡萄糖-2-羟基黄烷酮C-糖基转移酶通过体外酶法可以实现夏佛塔苷、异夏佛塔苷、白杨素-6-C-α-L-阿拉伯糖-8-C-β-D-葡萄糖、白杨素-6-C-β-D-葡萄糖-8-C-α-L-阿拉伯糖、3’-C-葡萄糖-5’-C-阿拉伯糖根皮素等类似物的合成。由此，本专利技术提供了一种合成葡萄糖和阿拉伯糖双糖基碳苷化合物的方法，包括：利用2-羟基黄烷酮C-糖基转移酶催化式I化合物和尿苷二磷酸葡萄糖反应生成式II化合物，再利用C-葡萄糖-2-羟基黄烷酮C-糖基转移酶催化式II化合物和尿苷二磷酸阿拉伯糖反应生成式III化合物，如下所示：其中，R1和R2可以相互独立或者R1和R2成环；当R1和R2相互独立时，R1为H、羟基或烷氧基，R2为H、烷基、烷氧基、苯基、取代苯基、苯基亚烷基、取代苯基亚烷基、苯氧基、取代苯氧基、苯基烷氧基、取代苯基烷氧基、苯乙酮基、对羟基苯乙酮基、3’,4’-二羟基苯乙酮基；或者，在式I中R1和R2成环，所述式I化合物结构如下：上式中，R为H或OH；相应得到的式II化合物结构如下：上式中，R为H或OH；相应得到的式III化合物结构如下：当R1为烷氧基时，所述烷氧基优选为本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种合成葡萄糖和阿拉伯糖双糖基碳苷化合物的方法，包括：利用2-羟基黄烷酮C-糖基转移酶催化式I化合物和尿苷二磷酸葡萄糖反应生成式II化合物，再利用C-葡萄糖-2-羟基黄烷酮C-糖基转移酶催化式II化合物和尿苷二磷酸阿拉伯糖反应生成式III化合物，如下所示：/n

【技术特征摘要】
1.一种合成葡萄糖和阿拉伯糖双糖基碳苷化合物的方法，包括：利用2-羟基黄烷酮C-糖基转移酶催化式I化合物和尿苷二磷酸葡萄糖反应生成式II化合物，再利用C-葡萄糖-2-羟基黄烷酮C-糖基转移酶催化式II化合物和尿苷二磷酸阿拉伯糖反应生成式III化合物，如下所示：



其中，R1和R2相互独立，R1为H、羟基或烷氧基，R2为H、烷基、烷氧基、苯基、取代苯基、苯基亚烷基、取代苯基亚烷基、苯氧基、取代苯氧基、苯基烷氧基、取代苯基烷氧基、苯乙酮基、对羟基苯乙酮基或3’,4’-二羟基苯乙酮基；或者，在式I中R1和R2成环，
所述式I化合物结构如下：

其中，R为H或OH；相应得到的式II化合物和式III化合物结构分别如下：



所述2-羟基黄烷酮C-糖基转移酶选自来自黄芩、甘草、一把伞南星、少根紫萍和大薸的2-羟基黄烷酮C-糖基转移酶SbCGTa、GuCGTa、AeCGTa、LpCGTa、PsCGTa，其氨基酸序列依次如序列表中SEQIDNo：14、18、20、22和24所示；所述C-葡萄糖-2-羟基黄烷酮C-糖基转移酶选自来自玉米、水稻、黄芩、甘草、一把伞南星、少根紫萍和大薸的C-葡萄糖-2-羟基黄烷酮C-糖基转移酶ZmCGTb、OsCGTb1、OsCGTb2、SbCGTb、GuCGTb、AeCGTb、LpCGTb、PsCGTb，其氨基酸序列依次如序列表中SEQIDNo：26、16、17、15、19、21、23和25所示。


2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，利用2-羟基黄烷酮C-糖基转移酶和C-葡萄糖-2-羟基黄烷酮C-糖基转移酶合成夏佛塔苷、异夏佛塔苷或其类似物，包括以下步骤：
1)2-羟基黄烷酮C-糖基转移酶催化2-羟基黄烷酮和尿苷二磷酸葡萄糖反应生成C-葡萄糖-2-羟基黄烷酮；



2)C-葡萄糖-2-羟基黄烷酮C-糖基转移酶催化C-葡萄糖-2-羟基黄烷酮和尿苷二磷酸阿拉伯糖反应生成C-阿拉伯糖-C-葡萄糖-2-羟基黄烷酮；



3)C-阿拉伯糖-C-葡萄糖-2-羟基黄烷酮经HCl处理脱水或自发脱水生成夏佛塔苷、异夏佛塔苷或其类似物白杨素-6-C-α-L-阿拉伯糖-8-C-β-D-葡萄糖、白杨素-6-C-β-D-葡萄糖-8-C-α-L-阿拉伯糖；



上述反应式中，R为OH或H；当R为OH时产物为夏佛塔苷和异夏佛塔苷同分异构体；
当R为H时产物为白杨素-6-C-α-L-阿拉伯糖-8-C-β-D-葡萄糖和白杨素-6-C-β-D-葡萄糖-8-C-α-L-阿拉伯糖同分异构体。


3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，合成产物为3’-C-葡萄糖-5’-C-阿拉伯糖根皮素，反应式如下：



2-羟基黄烷酮C-糖基转移酶催化根皮素和尿苷二磷酸葡萄糖反应生成3’-C-葡萄糖根皮素，C-葡...

【专利技术属性】
技术研发人员：乔雪，叶敏，王子龙，王双，陈宽，
申请(专利权)人：北京大学，
类型：发明
国别省市：北京;11