一种利用外源自交不亲和性的棉花育种方法技术

本申请属于棉花育种技术领域，具体涉及一种利用外源自交不亲和性的棉花育种方法的专利申请。本发明专利技术利用外源的虞美人自交不亲和性基因对PrsS/PrpS，结合基因工程技术将其导入了棉花，证明在棉花中导入虞美人自交不亲和系统，可以实现棉花自交不亲和表型，表明自交不亲和性可以在棉花中成功实现（以转基因株系Gh‑PrsS为父本，Gh‑PrpS为母本，不能正常产生棉铃，可实现棉花的自交不亲和性，也即，可以实现棉花由自交亲和向自交不亲和的转变）。利用该方法可以成功创制不同的棉花自交不亲和新材料，从而大幅节约人工成本，提高制种的纯度和效率，而且可以突破材料的基因型限制，实现高效制种的强优势杂交棉培育。

【技术实现步骤摘要】
一种利用外源自交不亲和性的棉花育种方法
本申请属于棉花育种
，具体涉及一种利用外源自交不亲和性的棉花育种方法的专利申请。
技术介绍
棉花是我国重要的经济作物，其纤维是我国纺织工业必不可少的原材料。棉花为自交亲和作物，在没有外界干预的情况下多为自花授粉。而从棉花育种角度而言，利用杂种优势能够大幅度提高棉纤维产量，改善纤维品质，增强植株抗病虫能力。目前棉花的杂交制种的方法主要有：人工去雄、化学杀雄和雄性不育系等方法，但这些方法均存在费时费工、环境不友好、效果不稳定等一种或多种问题，使得规模化应用难度较大。其主要原因在于：人工去雄制种时，由于操作繁琐，导致棉花杂交种的人工成本过高，进而严重限制了杂交棉的推广应用；而化学杀雄法存在效果不稳定、施用浓度和施用时间难以把控以及环境污染等问题；利用雄性不育系育种时，无论是核雄性不育的“两系法”还是胞质不育的“三系法”制种时，存在难于选配强优势组合的缺陷。因此，人工制种成本高、雄性不育系育性不稳、不育基因源狭窄和恢复系的恢复力差是限制棉花杂交种广泛应用的关键问题。也因此，降低杂交制种成本、并且开发一种较为稳定优良的雄性不育系育种方法，是棉花杂交制种技术发展的重要前提。自交不亲和性是正常可育的雌雄同花显花植物自花授粉不能产生合子的一种现象。作为一种种内生殖隔离机制，自交不亲和性在显花植物避免近亲繁殖保持遗传多样性方面发挥重要作用。生产实践中，育种家利用自交不亲和系做母本进行杂交制种，具有无需去雄、省时省工的明显技术优点。而随着对植物自交不亲和性形成分子机理研究的不断深入，利用生物技术人工创造自交亲和作物已经逐渐成为可能。已有研究表明，在绝大多数自交不亲和植物中，自交不亲和是由复等位基因构成的单一位点控制，称为S位点/基因座。S位点一般包含两类基因：决定花柱识别特异性的柱头S基因和决定花粉识别特异性的花粉S基因，二者构成不同的S单倍（元）型。当花粉的S单倍型与雌蕊两个S单倍型的其中一个相同时，花粉被雌蕊识别为“自己”，导致花粉生长受阻的排斥反应，我们称为自己花粉不亲和反应；而与雌蕊具有不同S单倍型的花粉被识别为“异己”，进而完成整个授粉受精的过程，我们称为异己花粉亲和反应。这些等位基因在雌蕊和花粉中的表达具有组织和时间特异性，受植物生长发育过程调控。基于现有自交不亲和性研究，如果能够开发一种棉花的自交不亲和性的育种方法，对于棉花的杂交制种技术的发展显然是一种新的技术思路和技术途径。
技术实现思路
利用现有虞美人自交不亲和性基因对PrsS/PrpS，专利技术人目的在于提供一种自交不亲和性的棉花育种新方法，从而为棉花杂交制种技术的发展奠定一定技术基础。本申请所采取的技术方案详述如下。棉花柱头特异启动子Ghstp，长度为2003bp，具体碱基序列如SEQIDNo.1所示。棉花花粉管特异启动子Ghpop，长度为2001bp，具体碱基序列如SEQIDNo.2所示。PCR扩增所述棉花柱头特异启动子Ghstp和棉花花粉管特异启动子Ghpop用引物序列，具体如下：Ghstp-F：5’-CTTTATAGTACCCAAAATTATTCTATT-3’，Ghstp-R：5’-CATTTTTTTTGAAGATGGAAAATGAATGAG-3’；Ghpop-F：5’-TAATCTAACCCATTAGTGAATGAGGCAA-3’，Ghpop-R：5’-TTGTGGTTGATGACTTCATCTTCCTCAAAT-3’。利用所述棉花柱头特异启动子Ghstp和棉花花粉管特异启动子Ghpop所构建的重组载体，包括：由棉花柱头特异启动子Ghstp和虞美人自交不亲和柱头决定基因PrsS融合构建的柱头不亲和表达载体Ghstp-PrsS-pBI121，和由花粉管特异启动子Ghpop和虞美人自交不亲和花粉管决定基因PrpS融合构建的花粉不亲和表达载体Ghpop-PrpS-pBI121；这两个重组载体以质粒pBI121为骨架载体构建获得，具体构建步骤为：（一）准备虞美人自交不亲和决定基因对虞美人自交不亲和决定基因对PrsS1（全长420bp）和PrpS1（全长579bp）具体基因序列如下：柱头决定基因PrsS（420bp）：ATGAACATATTTTATGTTATTGTGCTGCTATCGTTCTTCTTGTCCAAGTCAAGCGGTTTCTTTCCTGTTATTGAGGTGCGTATAATGAACAGAAGAGGTAACGGGAGGAGCATTGGCATCCATTGCCGATCCAAAGATAATGATCTTCAAAACCAAACAGTGACATCTGGTCATGACATGAGTTTTTCATTTAGGGAAGATTTTTTCCATACAACTCACTTCTATTGTGACCTACAATGGGATAAAGAAACAAAGTTCGGGTTTTATTCCTATCAGGCAAAGAGGGATGATGACGGTAGGTGCTCTTCCCAGTGCCTCTGGAAGATAATGGATGATGGTTTATACGGTTTTGATCAGGAGCATCAGATCTGGCAGATTTACCATTTGATAAAGAAAGAAAGGAAGGAAGGTCGAACCTGA花粉管决定基因PrpS（579bp）：ATGCCCCGAAGTGGAAGTGTTGTTACTTTATTTCAGTTTGTTGGAGGATTATGTACCCTGTTGGGAGTCTCAGTTGCCATAAAAGCTATTTTTGCTCAAGATTATACATTGAAAGATCTCATTATCCTAATTGTATTAGTTGCACTGTCAATAATACTGGGAGGACCAATCACCCTCACATGTGTCAAACTACTTGGCTTGGTTTTACATCGTCTTAGCTTTTCAGAAGATCAAAAGTGGGTAGTCGCATTTGGGACTGCTGCAATCTGTGATGTTCTTCTGGTACCCAAAAATATGTTACCAATGACCATTTTTTCCTTCTTATCTTCCATAATGATCTGTGTGGTCGCTGTTGGTTGGGATTGCGACCGAAGTGGCATGACCGAAGGATTTTTGGTTGGGTTTGGCAAGCTTCTACTAGTATACTTGATCAAACAAGATTTTACTTTTTCATTGTTGTGTGGATCAGTTCTCTGCCTCGCAGTTGTTGCTAAGTTCACAGAAGGTAAGGCTGAAGCCACTCCAAATCCAAATCTCGCTGGAAAAGCGGATTCCCCTCATCTTATAACTCAAGCTTAA；（二）分别构建柱头不亲和表达载体Ghstp-PrsS-pBI121和花粉管自交不亲和表达载体Ghpop-PrpS-pBI121以HindIII和BamHI作为酶切位点，分别对质粒pBI121和含有Ghstp或Ghpop基因的pMD19质粒进行双酶切，并回收酶切本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.棉花柱头特异启动子Ghstp，其特征在于，启动子Ghstp长度为2003bp，具体碱基序列如SEQ ID No.1所示。/n

【技术特征摘要】
1.棉花柱头特异启动子Ghstp，其特征在于，启动子Ghstp长度为2003bp，具体碱基序列如SEQIDNo.1所示。


2.棉花花粉管特异启动子Ghpop，其特征在于，启动子Ghpop长度为2001bp，具体碱基序列如SEQIDNo.2所示。


3.PCR扩增权利要求1所述棉花柱头特异启动子Ghstp和权利要求2所述棉花花粉管特异启动子Ghpop用引物序列，其特征在于，具体如下：
Ghstp-F：5’-CTTTATAGTACCCAAAATTATTCTATT-3’，
Ghstp-R：5’-CATTTTTTTTGAAGATGGAAAATGAATGAG-3’；
Ghpop-F：5’-TAATCTAACCCATTAGTGAATGAGGCAA-3’，
Ghpop-R：5’-TTGTGGTTGATGACTTCATCTTCCTCAAAT-3’。


4.利用权利要求1所述棉花柱头特异启动子Ghstp和权利要求2所述棉花花粉管特异启动子Ghpop所构建的重组载体，其特征在于，包括：由棉花柱头特异启动子Ghstp和虞美人自交不亲和柱头决定基因PrsS融合构建的柱头不亲和表达载体Ghstp-PrsS-pBI121，和由花粉管特异启动子Ghpop和虞美人自交不亲和花粉决定基因PrpS融合构建的花粉不亲和表达载体Ghpop-PrpS-pBI121；这两个重组载体以质粒pBI121为骨架载体构建获得，具体构建获得步骤为：
（一）准备虞美人自交不亲和决定基因对
虞美人自交不亲和决定基因对PrsS1和PrpS1具体基因序列如下：
柱头决定基因PrsS：
ATGAACATATTTTATGTTATTGTGCTGCTATCGTTCTTCTTGTCCAAGTCAAGCGGTTTCTTTCCTGTTATTGAGGTGCGTATAATGAACAGAAGAGGTAACGGGAGGAGCATTGGCATCCATTGCCGATCCAAAGATAATGATCTTCAAAACCAAACAGTGACATCTGGTCATGACATGAGTTTTTCATTTAGGGAAGATTTTTTCCATACAACTCACTTCTATTGTGACCTACAATGGGATAAAGAAACAAAGTTCGGGTTTTATTCCTATCAGGCAAAGAGGGATGATGACGGTAGGTGCTCTTCCCAGTGCCTCTGGAAGATAATGGATGATGGTTTATACGGTTTTGATCAGGAGCATCAGATCTGGCAGATTTACCATTTGATAAAGAAAGAAAGGAAGGAAGGTCGAACCTGA
花粉管决定基因PrpS：
ATGCCCCGAAGTGGAAGTGTTGTTACTTTATTTCAGTTTGTTGGAGGATTATGTACCCTGTTGGGAGTCTCAGTTGCCATAAAAGCTATTTTTGCTCAAGATTATACATTGAAAGATCTCATTATCCTAATTGTATTAGTTGCACTGTCAATAATACTGGGAGGACCAATCACCCTCACATGTGTCAAACTACTTGGCTTGGTTTTACATCGTCTTAGCTTTTCAGAAGATCAAAAGTGGGTAGTCGCATTTGGGACTGCTGCAATCTGTGATGTTCTTCTGGTACCCAAAAATATGTTACCAATGACCAT...

【专利技术属性】
技术研发人员：李志芳，江静，王灵璞，王鹏宇，王朋宝，李成，程祥飞，胡佳敏，郑炬瑞，迈克·斯科特·杜邦，
申请(专利权)人：河南大学，
类型：发明
国别省市：河南;41