一种具有光热增强酶活性的磁性氧化石墨烯基固定化乳糖酶及其制备方法技术

本发明专利技术提供了一种具有光热增强酶活性的磁性氧化石墨烯基固定化乳糖酶及其制备方法，属于生物化学领域。本发明专利技术首先制备磁性纳米颗粒‑氧化石墨烯，并用芘丁酸和聚乙烯亚胺对其进行改性，所得材料负载能力高，稳定性好，能够实现近红外光照射下酶活性的光热增强，然后通过戊二醛活化该材料与乳糖酶共价偶联，得到了固定化乳糖酶。本发明专利技术突破了以往不能分离和回收可溶性乳糖，限制实践中的连续和长期应用。本发明专利技术所得固定化乳糖酶在近红外光照射下酶活性约为可溶性乳糖酶活性的152％，而且酶具有很高的稳定性和可重复利用性，有助于微球反应器的连续运行，使固定化酶技术在未来的工业领域具有广阔的应用前景。

【技术实现步骤摘要】
一种具有光热增强酶活性的磁性氧化石墨烯基固定化乳糖酶及其制备方法
本专利技术涉及生物化学领域，具体涉及一种具有光热增强酶活性的磁性氧化石墨烯基固定化乳糖酶及其制备方法。
技术介绍
酶是一种高度特异性的生物催化剂，在工业过程、环境领域、疾病诊断等领域有着广泛的应用。在各种酶中，乳糖酶(β-半乳糖苷酶)在催化乳糖转化为半乳糖和葡萄糖乳制品行业中是一个很重要的酶。近年来，水解反应在干酪乳清的改良、产品甜度和品质的改善、有价值的半乳糖和无乳糖乳制品的生产等方面得到了广泛的关注。乳糖不耐症是世界上一半以上人口的普遍情况，它可导致多种消化系统症状，包括腹痛、腹泻和排气。用乳糖酶作为补充物和水解乳糖是解决症状的可行手段。但是在一直变化的热化学环境中其稳定性很差，不能分离和回收可溶性乳糖，限制了在实践中的连续和长期应用。开发有效的方法来提高酶的稳定性和可重复利用性是非常必要的。在适当的固体载体上固定化酶是克服酶活性低、稳定性差、可重复利用等缺点的有效方法。目前已开发出几种固定化乳糖酶的方法，包括吸附、封装和共价键合。物理吸附方法便捷，但酶与载体间的相互作用较弱，容易导致酶的泄露。水凝胶珠用于乳糖酶的包封，提高了酶的稳定性，但较大的孔径会导致酶的快速泄漏。另外，其机械强度差、尺寸大，限制了进一步的应用。通过比较，化学共价固定化乳糖酶的效果较小尺寸矩阵提供了良好的键合稳定性和可恢复性，几种基质包括有机材料(如天然和合成聚合物)和无机材料(如多壁碳纳米管、磁性纳米复合材料和二氧化硅颗粒)已成功用于固定化乳糖酶。酶稳定性的提高有助于微球反应器的连续运行，使固定化酶技术在未来的工业领域具有广阔的应用前景。近年来，人们制备了多种等离子体纳米复合材料作为功能载体，在光辐射条件下实现酶的固定化和增强酶的活性。与传统的散体加热方法不同，等离子体纳米结构具有良好的光热转换能力，可以实现快速局部加热。酶活性可通过调节光照时间和光照功率来控制。Singamaneni等报道了金纳米棒介导的固定化酶活性的光热增强。Fan等采用Ti3C2Tx纳米片作为载体和光热材料，提高了脂肪酶的催化活性。氧化石墨烯(GO)是一种典型的二维纳米片材料，具有高比表面积、大量的活性基团和优异的光热性能。由于这些独特的物理和化学特性，氧化石墨烯和氧化石墨烯基纳米复合材料已被证明是蛋白质固定化、药物传递和光热转换的高性能平台。可以预见，氧化石墨烯基是有希望同时实现乳糖酶的固定化和酶活性的光热增强这个目标的候选材料。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种具有光热增强酶活性的磁性氧化石墨烯基固定化乳糖酶及其制备方法，解决了乳糖酶(β-半乳糖苷酶)的酶的活性易受影响，稳定性差及可溶性乳糖酶的重复利用性差，阻碍了其连续、长期的使用。为了实现上述目的，本专利技术采用如下技术方案：一种具有光热增强酶活性的磁性氧化石墨烯基固定化乳糖酶，该固定化乳糖酶采用戊二醛激活功能载体上的氨基与乳糖酶键合；所述功能载体为改性磁性氧化石墨烯纳米复合材料，所述材料以氧化石墨烯为原料由溶剂热反应合成磁性纳米粒子-氧化石墨烯纳米复合材料，并用芘丁酸和聚乙烯亚胺对其改性而得。进一步的，该固定化乳糖酶的最适反应pH值为5.0，最适反应温度为38～41℃，反应动力学常数Km为8.52mmol/L，Vmax为38.2mmol/min。进一步的，所述改性磁性氧化石墨烯纳米复合材料固定化乳糖酶的负载比例达到278.8mg/g。进一步的，所述改性磁性氧化石墨烯纳米复合材料的制备及固定酶的过程使得结构更加粗糙，保障了酶的稳定性和可重复利用性。进一步的，该固定化乳糖酶分散有纳米磁性粒子，在磁分离和水解反应的连续操作过程中可表现出良好的重复使用性能。一种具有光热增强酶活性的磁性氧化石墨烯基固定化乳糖酶的制备方法，该制备方法包括如下步骤：(1)取氧化石墨烯进行超声处理后，分散于氧化石墨烯质量900～1100倍的乙二醇中混合，得混液，依次加入混液质量0.48～0.55％的六水氯化铁、混液质量1.98～2.43％的乙酸钠、混液质量0.085～0.11％的柠檬酸钠混合，得混合物，将混合物以超声波处理，转移到高压釜在190～220℃条件下反应，冷却，收集产物后用乙醇和去离子水清洗，干燥，得mGO，然后按质量比4～6：1取mGO和芘丁酸分散在mGO质量460～520倍的丙酮溶液中，并将混合溶液在25～35℃下超声处理，搅拌，磁分离mg-pba产物，再用无水乙醇洗涤，干燥，得到mGP，按质量比10：3～4：700～900取mGP和聚乙烯亚胺分散在乙醇溶液中，在28～32℃下进行交联反应，得mGP-PEI，水洗，干燥，即为改性磁性氧化石墨烯纳米复合材料；(2)按质量比1：560～650取干燥后的mGP-PEI分散于乙酸缓冲液中，在28～33℃下震荡，再用醋酸缓冲液洗涤，将活化后的mGP-PEI与含有1.0mg/mL乳糖酶的醋酸缓冲液混合，将悬浮液在28～32℃下放置4～6h，用醋酸缓冲液磁选洗涤，即得具有光热增强酶活性的磁性氧化石墨烯基固定化乳糖酶。进一步的，所述步骤(1)中经高压釜处理后用磁铁收集产物。进一步的，所述步骤(1)中的乙醇溶液中含有20mmol/L的1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐和8mmol/L的N-羟基琥珀酰亚胺。进一步的，所述步骤(2)中的所述乙酸缓冲液的浓度为0.1mol/L，pH为5.0，并含有质量分数为2.5％的戊二醛。进一步的，所述步骤(2)中的醋酸缓冲液浓度0.1mol/L，pH为5.0。综上所述，由于采用了上述技术方案，本专利技术的有益效果是：(1)本专利技术制备用于乳糖酶固定化的功能性磁性氧化石墨烯纳米复合材料的过程，采用了包括溶剂热反应合成磁性纳米粒子-氧化石墨烯纳米复合材料(MGO)，以及随后通过各自的π相互作用和静电相互作用对芘丁酸和聚乙烯亚胺表面改性，在戊二醛激活后，乳糖酶共价固定在功能载体上的氨基上，受益于芘丁酸和聚乙烯亚胺的引入，表面活性基团和由此产生的键合能力显著提高，由于氧化石墨烯组分的光热特性，在近红外光照射下，固定化乳糖酶周围的局部温度升高，通过调节光照参数，可使固定化乳糖酶的酶活性显著提高。(2)本专利技术突破了以往不能分离和回收可溶性乳糖限制了其在实践中的连续和长期应用的问题；近红外光照射下mGPP-乳糖酶的酶活性约为可溶性乳糖酶活性的152％，能够有效地降解聚乳糖；提高酶的稳定性和可重复利用性，有助于微球反应器的连续运行，使固定化酶技术在未来的工业领域具有广阔的应用前景。(3)本专利技术提供了一种制备磁性纳米粒子-氧化石墨烯纳米复合材料的方法，并将所得材料作为乳糖酶共价固定的功能载体，并详细研究了几种固定参数对负载量、固定效率和酶活性的影响，由于mGPP具有多种组分和独特的结构，使其具有高的负载能力，所以其能在较广的pH溶液和温度条件下具有良好的稳定性。此外，本申请还试验了mGPP的光热特性对固定化乳糖酶酶活性的影响，结果表明，mGPP在近红外本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种具有光热增强酶活性的磁性氧化石墨烯基固定化乳糖酶，其特征在于，该固定化乳糖酶采用戊二醛激活功能载体上的氨基与乳糖酶键合；/n所述功能载体为改性磁性氧化石墨烯纳米复合材料，所述材料以氧化石墨烯为原料由溶剂热反应合成磁性纳米粒子-氧化石墨烯纳米复合材料，并用芘丁酸和聚乙烯亚胺对其改性而得。/n

【技术特征摘要】
1.一种具有光热增强酶活性的磁性氧化石墨烯基固定化乳糖酶，其特征在于，该固定化乳糖酶采用戊二醛激活功能载体上的氨基与乳糖酶键合；
所述功能载体为改性磁性氧化石墨烯纳米复合材料，所述材料以氧化石墨烯为原料由溶剂热反应合成磁性纳米粒子-氧化石墨烯纳米复合材料，并用芘丁酸和聚乙烯亚胺对其改性而得。


2.根据权利要求1所述的具有光热增强酶活性的磁性氧化石墨烯基固定化乳糖酶，其特征在于，该固定化乳糖酶的最适反应pH值为5.0，最适反应温度为38～41℃，反应动力学常数Km为8.52mmol/L，Vmax为38.2mmol/min。


3.根据权利要求1所述的具有光热增强酶活性的磁性氧化石墨烯基固定化乳糖酶，其特征在于，所述改性磁性氧化石墨烯纳米复合材料固定化乳糖酶的负载比例达到278.8mg/g。


4.根据权利要求1所述的具有光热增强酶活性的磁性氧化石墨烯基固定化乳糖酶，其特征在于，所述改性磁性氧化石墨烯纳米复合材料的制备及固定酶的过程使得形成的结构更加粗糙，保障了酶的稳定性和可重复利用性。


5.根据权利要求1所述的具有光热增强酶活性的磁性氧化石墨烯基固定化乳糖酶，其特征在于，该固定化乳糖酶分散有纳米磁性粒子，在磁分离和水解反应的连续操作过程中可表现出良好的重复使用性能。


6.一种如权利要求1～5任意一项所述的具有光热增强酶活性的磁性氧化石墨烯基固定化乳糖酶的制备方法，其特征在于，该制备方法包括如下步骤：
(1)取氧化石墨烯进行超声处理后，分散于氧化石墨烯质量900～1100倍的乙二醇中混合，得混液，依次加入混液质量0.48～0.55％的六水氯化铁、混液质量1.98～2.43％的乙酸钠、混液质量0.085～0.11％的柠檬酸钠混合，得混合物，将混合物以超声波处理，...

【专利技术属性】
技术研发人员：郇伟伟，郭建忠，李洁，李迎龙，李高羽，
申请(专利权)人：浙江农林大学，
类型：发明
国别省市：浙江;33