基于CRISPRCAS9技术构建MyoD1基因敲除的MDBK细胞系的方法技术

本发明专利技术公开了一种CRISPRCAS9技术构建MyoD1基因敲除的MDBK细胞系的方法，该方法利用携带MyoD1基因的sgRNA病毒液感染MDBK细胞敲除MyoD1基因，MyoD1基因敲除的MDBK细胞可于下游研究MyoD1基因的功能及与其相关的调控机制或通路。

【技术实现步骤摘要】
基于CRISPRCAS9技术构建MyoD1基因敲除的MDBK细胞系的方法
本专利技术属于生物
，尤其是一种基于CRISPRCAS9技术构建MyoD1基因敲除的MDBK细胞系的方法。
技术介绍
CRISPRCAS9技术是目前运用广泛的进行基因编辑的技术手段，相比之前的编辑手段，高效，靶向性精确，易操作，缩短了实验周期，减少了实验成本。CRISPRCAS9是细菌和古细菌在长期进化中形成的免疫防御机制，目前典型的作用机制是crRNA(CRISPR-derivedRNA)通过碱基配对与tracrRNA(trans-activatingRNA)结合形成tracrRNA/crRNA复合物，此复合物引导核酸酶Cas9蛋白在与crRNA配对的序列靶位点剪切双链RNA。通过设计这两种RNA，形成具有引导作用的sgRNA(shortguideRNA)，引导Cas9对DNA的定点切割，作用原理如图所示。2012年美国研究人员在《分子治疗》上发表了利用CRISPR技术对生物的DNA序列进行编辑，并开发出研究疾病和药物测试的模型相关研究的文章，此后CRIS本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种基于CRISPRCAS9技术构建MyoD1基因敲除的MDBK细胞系的方法，其特征在于：向lentiCRISPR v2载体中插入设计好的4组sgRNA；将含绿色荧光蛋白基因GFP的质粒用脂质体2000(Invitrogen)转入MDBK细胞；采用梯度稀释法，将MDBK细胞稀释至1个/100/100μL，传至96孔板，每孔加入100μL；共铺单克隆1*96孔，经过12天的生长周期后，单克隆长出核心质粒，将获得的核心质粒包装慢病毒感染靶细胞。/n

【技术特征摘要】
1.一种基于CRISPRCAS9技术构建MyoD1基因敲除的MDBK细胞系的方法，其特征在于：向lentiCRISPRv2载体中插入设计好的4组sgRNA；将含绿色荧光蛋白基因GFP的质粒用脂质体2000(Invitrogen)转入MDBK细胞；采用梯度稀释法，将MDBK细胞稀释至1个/100/100μL，传至96孔板，每孔加入100μL；共铺单克隆1*96孔，经过12天的生长周期后，单克隆长出核心质粒，将获得的核心质粒包装慢病毒感染靶细胞。


2.根据权利要求1所述的基于CRISPRCAS9技术构建MyoD1基因敲除的MDBK细胞系的方法，其特征在于，所述的核心质粒包装慢病毒感染靶细胞包括入下步骤：
(1)按照核心质粒lentiCRISPRv2-MyoD1-sgRNA：psPAX2p：pMD2.G＝2：1：1的比例转染6孔板293T细胞，分别包装成含各个sgRNA的慢病毒；
(2)将包装好的4种慢病毒混合分两次感染同一个孔的MDBK细胞；
(3)48小时后，加入2μg/mL的puro进行筛选出感染成功的细胞，继续培续培养48小时；
(4)加入2μg/mL的puro进行二次筛选，继续培养48小时，直至未被成功感染的细胞基本死亡；
(5)取部分混合细胞提基因组DNA扩增靶点，检测整体敲除效果；
(6)其余细胞以每孔1个细胞的密度分到96孔板中，长满后扩大到24孔板中，长满后扩大到6孔板中，每个孔取部分细胞提基因组DNA扩增靶点检测...

【专利技术属性】
技术研发人员：周迪，毛世明，龙清孟，赵忠海，谢燕，陈光侯，张小玉，谭晓山，李俊，李建伟，李明勇，谢玲玲，刘虓，李平，申金容，
申请(专利权)人：贵州省种畜禽种质测定中心，
类型：发明
国别省市：贵州;52