LAG-3剪接变体制造技术

本发明专利技术涉及一种分离的核苷酸序列，它选自下列序列：ａ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３或ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５的核苷酸序列；ｂ）在严谨条件下与ａ）定义的任一序列杂交且编码的多肽是ＬＡＧ－３分子变体的核苷酸序列；ｃ）遗传密码与ａ）和ｂ）所确定的核苷酸序列简并、且编码的多肽是ＬＡＧ－３分子基因型变体的核苷酸序列。（*该技术在2018年保护过期，可自由使用*）

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及LAG-3分子的不同剪接变体的鉴定及其作为免疫调节剂的用途。现在已经认识到，MHC II类区域编码的蛋白参与了免疫识别的许多方面，包括不同淋巴样细胞(如淋巴细胞和抗原呈递细胞)之间的相互作用。不同的观察结果还表明，不通过CD4发生的其它机制参与了T辅助淋巴细胞的效应功能。人激活的T和NK细胞中表达的淋巴细胞激活基因3(LAG-3)编码了498个氨基酸(aa)的I型膜蛋白，其具有四个细胞外免疫球蛋白超家族(IgSF)结构域(1)。分析该序列表明，尽管整个氨基酸序列与人CD4的同源性仅高于背景水平(约20％的序列相同性)，但是有值得注意的一小段序列与CD4对应位置上发现的一段氨基酸序列相同。在LAG-3分子内，在结构域1(D1)和3(D3)之间以及结构域2(D2)和4(D4)之间发现有一些内部下列同源，这提示LAG-3象CD4一样通过预先存在的2 IgSF结构(1)基因复制而进化得到。另外，LAG-3和CD4基因在染色体12短臂远部上非常靠近(2，B.Huard，P.Gaulard，F.Faure，T.Hercend，F.Triebel，Immunogenetics 39，213，1994)。因此，LAG-3和CD4可视作是IgSF中进化上的“第一代表亲”(2)。本专利技术者以前采用定量细胞粘附试验曾表明，LAG-3转染的Cos-7细胞和MHC II+型B淋巴细胞之间的花结形成特异性地取决于LAG-3/MHC II型相互作用(3)。用LAG-3Ig融合蛋白还观察到LAG-3与各种人II型分子(包括不同等位基因和同种型)、以及和小鼠及猴II型分子之间有直接和特异性的结合(4)。该二聚LAG-3Ig重组球蛋白与MHC II型分子单型残基结合的亲合力比CD4Ig高得多(Kd＝60nM，37℃)(5)；LAG-3Ig实际上能在细胞间粘附试验中阻断CD4/MHC II型相互作用(5)。已经用LAG-3特异性单克隆抗体(mAb)(6)和LAG-3Ig分子(7)研究了LAG-3/II型分子相互反应所起的作用。这种相互反应导致下游的T细胞克隆激活。产生LAG-3/MHC II型相互作用通过T-T细胞接触来介导，据推测是通过阴性MHCII型信号传导到T细胞。总之，在体外和在体内，LAG-3都仅仅在淋巴细胞激活后才表达(6)，因此它在应答的诱导阶段中不起作用(与CD4相反)。此外，单克隆抗体阻断试验已经表明，LAG-3没有参与MHC II型限制的CD4+T细胞克隆的识别阶段。因此，LAG-3的功能作用显然与其它MHC配体CD4和CD8的功能不同。目前认为，T细胞MHC II型分子起的作用与CTLA-4在LAG-3结合后所起作用类似(4)，即诱导以前激活的T细胞克隆性缺失(8)。最近已经发现，LAG-3优先被激活的Th1细胞(即产生IFN-γ和TNF的T辅助细胞)表达和释放，并可由IL-12(一种强效的Th1-诱导性细胞因子)上调(F.Annunziato，R.Manetti，L.Tomasevic，MG.Giudizi，R.Biagiotti，V.Gianno，P.Germano，C.Mavilia，E.Maggi和S.Romagnani，FASEB J.10，769-775，1996)。在患复发性多发性硬化(MS)的患者(出处同上)和患系统性红斑狼疮的少数患者(S.Romagnani，clin.Immun0l.Immunopath.80，225-535，1996)的血清中也发现了高水平的可溶性LAG-3(sLAG-3)。这些发现提示，LAG-3可以作为Th1介导的免疫疾病(如桥本氏甲状腺炎、I型糖尿病、多发性硬化、Chron’s疾病、类风湿性关节炎、急性异体移植排斥反应和急性移植物抗宿主疾病(GVHD))的有用的诊断标记物。另一方面，MS患者以及可能患上述疾病的其它患者血清中存在高水平的sLAG-3支持了sLAG-3天然存在的保护作用，因为它能与膜结合形式竞争，从而阻断了LAG-3介导的免疫应答。本专利技术者已经调查了是否因为核转录物的其它剪接而表达出其它形式的LAG-3。大多数编码真核蛋白的基因所含序列在对应的成熟mRNA中以不连续的DNA片段(外显子)存在，外显子之间散布有不形成成熟mRNA部分的序列(内含子)。因此，这些基因的初级转录物含有对应于外显子的序列和对应于内含子的序列。随后，内含子序列经细胞核多步加工(称为预初mRNA剪接)而切除。即，内含子以其5’(供体)和3’(受体)边界共有序列为界。剪接过程包括受体位点的断裂以及伴随的5’和3’外显子的连接。在大多数情况下，基因中存在的外显子通过连续供体对和受体剪接位点的恒定连接插入一个成熟的mRNA中，产生了单基因产物。然而，在一些情况下，相同的基因含有可能导致不同转录物的另一种剪接位点。关于调节该可变剪接的机制还不清楚，但是至少某些基因，已经知道是细胞和发育特异性的。另一种剪接导致单基因产生多个蛋白同种型。这是产生蛋白多样性的一种分子加工。目前已经知道50种以上的基因通过多种剪接产生蛋白多样性。该机制在伸缩性蛋白基因中特别常见和完善。本专利技术者已经发现了三种新的以不同方式剪接的LAG-3变体，它们各自称为LAG-3V1、LAG-3V2和LAG-3V3。LAG-3V1编码可溶性36kD蛋白，其在D2结构域后有8个新的氨基酸残基，LAG-3V2编码61kD的跨膜蛋白，它不含结构域D4，而LAG-3V3编码52kD的可溶性蛋白，其在D3结构域后含有8个新的氨基酸残基。这些变体为研究LAG-3基因的调节作用以及其蛋白的生物功能提供了新的方法，可用于产生新的免疫调节化合物、尤其是模仿LAG-3生物功能的化合物或能作为LAG-3和MHC II型分子之间相互作用的促效剂或对抗剂的化合物。因此，本专利技术的主题是一种分离的核苷酸序列，它选自下列序列a)SEQ ID NO1、SEQ ID NO3或SEQ ID NO5的核苷酸序列；b)在严谨条件下与a)定义的任一序列杂交且编码的多肽是LAG-3分子变体的核苷酸序列；c)遗传密码与a)和b)所确定的核苷酸序列简并、且编码的多肽是LAG-3分子基因型变体的核苷酸序列。本专利技术还涉及由上述核苷酸序列编码的纯化的多肽。所述多肽在下文称为“LAG-3变体”。本专利技术还涉及包含LAG-3变体多肽的药物组合物。这些组合物可用来治疗与免疫有关的病理，尤其是Th1依赖型疾病如Hashimoto’s甲状腺炎、I型糖尿病、多发性硬化、Chron’s疾病、类风湿性关节炎、急性移植排斥反应、急性GVHD、突眼型甲状腺肿(Grave′s)眼病、大脑疟疾、莱姆关节炎、反应性关节炎(耶尔森氏菌诱导的)、HCV诱导的慢性肝炎、原发性硬化性胆管炎(colangitis)、接触性皮炎、不能解释的反复流产、再生障碍性贫血和幽门螺旋菌诱导的胃窦炎。本专利技术还涉及用LAG-3变体生产免疫调节剂化合物的用途。这种化合物能模拟或改变LAG-3和/或LAG-3变体的生物功能，因此诱导了涉及LAG-3或其变体参与的细胞相互作用的某些变化。本专利技术还涉及多克隆或单克隆抗体、及其Fab、Fab’和F(ab)’2或Fv片段，涉及上述定义的一种LAG-3变体的特异性表位。这些特异本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种分离的核苷酸序列，它选自下列序列：ａ）ＳＥＱＩＤＮＯ：１、ＳＥＱＩＤＮＯ：３或ＳＥＱＩＤＮＯ：５的核苷酸序列；ｂ）在严谨条件下与ａ）定义的任一序列杂交且编码的多肽是ＬＡＧ－３分子变体的核苷酸序列；ｃ）遗传密码与ａ）和ｂ）所确定的核苷酸序列简并、且编码的多肽是ＬＡＧ－３分子基因型变体的核苷酸序列。

【技术特征摘要】
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【专利技术属性】
技术研发人员：F特里贝尔，R马斯特拉格利，S罗马格尼，
申请(专利权)人：国家健康及医学研究院INSERM，古斯塔夫鲁西研究院，应用研究系统ARS股份公司，
类型：发明
国别省市：FR[法国]