一种利用近红外荧光蛋白衍生物或类似物进行近红外二区荧光成像的方法、装置及应用制造方法及图纸

本发明专利技术公开了一种利用近红外荧光蛋白衍生物或类似物进行近红外二区荧光成像的方法、装置及应用，同时提供近红外荧光蛋白iRFP713在近红外二区的表征；近红外荧光蛋白的发射波长在比传统的GFP类荧光蛋白发射光谱(～400‑600nm)更长的近红外区域，因此更适用于活体内生物成像。与目前GFP类荧光蛋白的生物成像以及近红外荧光蛋白在近红外一区(～700‑900nm)的成像应用相比，本发明专利技术的应用具有显著的穿透深度和空间分辨率的优势，将大大提高活体成像的穿透深度和信噪比。

【技术实现步骤摘要】
一种利用近红外荧光蛋白衍生物或类似物进行近红外二区荧光成像的方法、装置及应用
本专利技术涉及生物荧光成像
，尤其涉及一种利用近红外荧光蛋白衍生物或类似物进行近红外二区荧光成像的方法、装置及应用。
技术介绍
生物荧光成像技术是指利用生物组织或结构发出的荧光进行成像，用于研究生物学过程的方法。通过使用各种荧光标记物，荧光成像可以实现细胞水平、组织水平以及活体水平的成像研究，具有分辨率高、损伤小、成像快等优势，拥有广阔的应用前景。荧光探针的使用是荧光成像技术中的关键一环。目前常见的荧光探针包括小分子荧光染料、荧光纳米颗粒以及各种荧光蛋白。这几种探针中，化学修饰合成的纳米颗粒和荧光染料的荧光亮度虽然强，但其劣势也非常明显。一方面，它们不可再生，也不能随着细胞的复制而复制，因此并不适合用于研究一些需要长时间观察的生物学过程，比如肿瘤的发生发展以及转移等。另一方面，纳米颗粒和荧光染料在体内的运输过程中，经常会发生积聚沉淀，不易被排出体外，从而影响机体代谢。而荧光蛋白由于其本质是生物蛋白质，因此具备很好的生物兼容性，具有较低的细胞毒性。同时荧光蛋白能够特异性表达，使得荧光成像具备提供特异性的位置信息的能力，因此荧光蛋白成像已经广泛应用于生命科学的研究。目前，荧光蛋白成像在分子水平、细胞水平的研究应用已经极其成熟了。然而，在深层组织成像以及活体成像上还面临着很大的挑战，主要原因是成像时信号光的散射，组织对信号光吸收和自发荧光的干扰。比如，基于绿色荧光蛋白等传统荧光蛋白(GFP类荧光蛋白)的成像系统早已被开发改进，但由于其发射光谱的局限(仅仅400-600nm)，在组织细胞成像时背景信号较强，效果很不理想。而解决体内成像问题的方法就是使用发射波长在更长的近红外区域的荧光蛋白探针，即近红外荧光蛋白。目前，近红外荧光蛋白成像是生物荧光成像的研究热点之一。近红外荧光蛋白利用胆绿素作为发色团克服了GFP类荧光蛋白发色团基本原理上的限制。通过定向的进化，近红外荧光蛋白的激发和发射波长均在近红外“光学窗口”。在该波段内，信号光的散射较小、组织的自发荧光通常较低，因此具有更好的光穿透性，成像时的穿透深度更大，信噪比更高。
技术实现思路
本专利技术目的在于针对现有技术的不足，提出一种利用近红外荧光蛋白衍生物或类似物进行近红外二区荧光成像的方法、装置及应用。本专利技术的目的是通过以下技术方案来实现的：一种利用近红外荧光蛋白衍生物或类似物进行近红外二区荧光成像的方法，所述近红外荧光蛋白衍生物或类似物比GFP类荧光蛋白在近红外二区具有更长的荧光拖尾，近红外荧光蛋白衍生物或类似物在900nm以上具有可观的荧光信号，实现近红外荧光蛋白衍生物或类似物在近红外二区荧光成像。进一步地，所述的近红外二区是波长在900-1700nm区间。进一步地，所述近红外荧光蛋白衍生物或类似物包括iRFP670、iRFP682、iRFP702、iRFP720，以及单体近红外荧光蛋白miRFP670、miRFP703、miRFP709。一种利用近红外荧光蛋白衍生物或类似物进行近红外二区荧光成像的装置，该装置包括近红外二区宏观成像系统及近红外二区显微成像系统。所述近红外二区宏观成像系统包括透镜、光源、35mm定焦镜头、探测器和长通滤光片，所述光源为激光或LED；在宏观成像系统中，透镜设置在光源后，对激光器或LED的出射光进行扩束，使样品被均匀激发。借助35mm定焦镜头收集样品发出的荧光信号。根据需要选择不同截止波长的长通滤光片，并将其设置在定焦镜头与探测器之间以滤除背景信号。所述近红外二区显微成像系统包括透镜、光源、正置显微镜落射式照明器、二向色镜、物镜、长通滤光片和探测器；在显微成像系统中，准直透镜设置在正置显微镜落射式照明器及激光器或LED出射光之间。在落射式照明器中、物镜的正上方，设置长通短反二向色镜对激发光反射。在物镜前焦面的荧光信号经过设置在样品上方的物镜收集，并通过物镜上方的二向色镜。在管透镜及二向色镜之间设置不同截止波长的长通滤光片滤除背景，探测器靶面设置在管透镜上方。一种利用近红外荧光蛋白衍生物或类似物进行近红外二区荧光成像的应用，包括细胞成像应用、肠道菌群成像应用以及肿瘤标记成像应用。本专利技术的有益效果：现有技术中，近红外荧光蛋白在近红外一区活体成像信噪比、穿透深度及分辨率均较低，无法达到很好的成像效果。本专利技术首次发现并证实了近红外荧光蛋白iRFP在近红外二区(900-1700nm)的荧光发射足够用于荧光成像并取得很好的成像效果。基于这种成像特质，本专利技术提出了近红外荧光蛋白iRFP在近红外二区的全新应用，由此克服了近红外荧光蛋白在近红外一区活体成像信噪比低和穿透深度低及分辨率低的应用局限，突破了传统近红外二区荧光探针在长时间生命活动观察中的局限性；然后利用其在近红外二区的荧光性能，实现了高灵敏度和高穿透性的荧光成像技术。本专利技术通过分子生物学的方法纯化了8种近红外荧光蛋白，进而详细对比了它们在近红外一区和近红外二区的成像效果，并根据测试结果选择了近红外荧光蛋白iRFP713继续后续的活体内成像，证明了近红外荧光蛋白在近红外二区具有显著提高的成像效果。附图说明图1是实施例2、3、4、5的检测系统图，其中图1(a)为宏观成像系统图，1(b)为显微成像系统图。图中，1为电脑，2为InGaAs二维探测器，3为光源(激光器或LED)，4为物平面，5为长通滤光片，6为35mm定焦镜头，7为扩束透镜，8为管透镜，9为长通短反二向色镜，10为物镜，11为正置荧光显微镜落射式照明器；图2为实施例1中的8种材料的吸收光谱；图3为实施例1中的8种材料的荧光光谱，其中图3(a)为900-1600nm光谱，图3(c)为1000-1600nm光谱；图4为实施例1中的0.3mgmL-1明场和使用623nmLED、光照强度～60mWcm-2激光照射，经过1000LP滤光片后成像的荧光强度对比图；图5是实施例2中的模拟iRFP713在生物组织中穿透深度的近红外一/二区的对比图；图6是实施例3的细菌表达iRFP的近红外二区荧光成像结果图；图7是实施例3的细菌表达GFP和iRFP713的近红外二区荧光对比图；图8是实施例3的表达iRFP713的细菌在BALB/c小鼠体内的近红外二区成像效果图；图中左边一组为未开腹腔的成像效果，右组为打开腹腔后的成像效果，每组从左往右，从上往下为按时间顺序的成像结果；图9是实施例3的表达iRFP713的细菌在BALB/c小鼠体内近红外二区成像视频的截取的单帧图像；图10是实施例4的稳定表达几种iRFP的细胞近红外二区荧光成像结果图；图11是实施例4中稳定表达iRFP713和luciferase的LM3细胞近红外二区成像结果图；图12是实施例5中肿瘤小鼠的近红外二区和luciferase化学发光成像结果图。具体实施方式以下结合附图对本专利技术具体实施方式作进一步详细说明。...

【技术保护点】
1.一种利用近红外荧光蛋白衍生物或类似物进行近红外二区荧光成像的方法，其特征在于，所述近红外荧光蛋白衍生物或类似物比GFP类荧光蛋白在近红外二区具有更长的荧光拖尾，近红外荧光蛋白衍生物或类似物在900nm以上具有可观的荧光信号，实现近红外荧光蛋白衍生物或类似物在近红外二区荧光成像。/n

【技术特征摘要】
1.一种利用近红外荧光蛋白衍生物或类似物进行近红外二区荧光成像的方法，其特征在于，所述近红外荧光蛋白衍生物或类似物比GFP类荧光蛋白在近红外二区具有更长的荧光拖尾，近红外荧光蛋白衍生物或类似物在900nm以上具有可观的荧光信号，实现近红外荧光蛋白衍生物或类似物在近红外二区荧光成像。


2.根据权利要求1所述的利用近红外荧光蛋白衍生物或类似物进行近红外二区荧光成像的方法，其特征在于，所述的近红外二区是波长在900-1700nm区间。


3.根据权利要求1所述的利用近红外荧光蛋白衍生物或类似物进行近红外二区荧光成像的方法，其特征在于，所述近红外荧光蛋白衍生物或类似物包括iRFP670、iRFP682、iRFP702、iRFP720，以及单体近红外荧光蛋白miRFP670、miRFP703、miRFP709。


4.一种利用近红外荧光蛋白衍生物或类似物进行近红外二区荧光成像的装置，其特征在于，该装置包括近红外二区宏观成像系统及近红外二区显微成像系统。...

【专利技术属性】
技术研发人员：钱骏，盛静浩，许正平，冯哲，陈木雄，
申请(专利权)人：浙江大学，
类型：发明
国别省市：浙江;33