用于改进细胞核/细胞质RNA分离效率的RNA提取方法及应用技术

本发明专利技术提供了一种用于改进细胞核/细胞质RNA分离效率的RNA提取方法及应用，涉及分子生物技术领域，本发明专利技术提供的用于改进细胞核/细胞质RNA分离效率的RNA提取方法，在进行细胞裂解后进行细胞计数，当死亡细胞占总细胞量的60‑80％时停止裂解，然后再进行后续的RNA提取操作。该方法通过统计死亡细胞数量占比，能够掌握细胞裂解程度，从而有效防止细胞裂解过度或裂解不足，避免细胞膜裂解过度导致核膜裂解，胞质RNA受到胞核RNA的污染的问题，或者由于裂解不足而使得提取到的胞质RNA的量低于实际细胞质中RNA的含量的问题，提高胞质/胞核的分离效率。

【技术实现步骤摘要】
用于改进细胞核/细胞质RNA分离效率的RNA提取方法及应用
本专利技术涉及分子生物
，尤其是涉及用于改进细胞核/细胞质RNA分离效率的RNA提取方法及应用。
技术介绍
功能基因组学领域对基因表达分析最感兴趣。现在人类基因组已经完成测序，非常需要鉴定涉及疾病的基因和突变。这些基因可能是上调或下调基因，或者是多态性基因。用于分析这些基因的许多方法包括分离RNA。目前常规RNA分离方法是由细胞分离总RNA。该方式分离的RNA包括胞质的RNA和胞核的RNA，通过逆转录之后用实时荧光定量PCR的方法进行定量和分析。这些方法中所使用的原料一直是细胞或组织样品的总RNA或poly(A)+RNA。一方面这种方法无法满足分别对定位于细胞核/细胞质的非编码RNA的研究。同时，使用全细胞的总RNA时，结果是转录产物以及胞质降解产物的混合物。其中，最传统的细胞核/质分离提取RNA方法(蔗糖密度梯度离心法)分两步：(1)差速离心分离细胞器：在密度均一的介质(如蔗糖)中由低速到高速逐级离心，用于分离不同大小的细胞和细胞器。在差速离心中细胞器沉降的顺序依次为：核、线粒体、溶酶体与过氧化物酶体、内质网与高基体、最后为核蛋白体。由于各种细胞器在大小和密度上相互重叠，而且某些慢沉降颗粒常常被快沉降颗粒裹到沉淀块中，一般重复2～3次效果会好一些。差速离心只用于分离大小悬殊的细胞，更多用于分离细胞器。通过差速离心可将细胞器初步分离，常需进一步通过密度梯离心再行分离纯化。速度逐渐提高，样品按大小先后沉淀。(2)核酸的分离纯化。上述方法存在操作繁琐、耗时较长、对离心机等硬件要求高的缺点，并且，梯度离心分离得到的各组分纯度并不高。此外，目前市面上已经有的一些商品化的细胞核/质分离试剂盒，例如Millipore及BioVision等公司的核/质提取试剂盒，其操作过程有一步是离心之后吸取上清(胞质成分)，沉淀为胞核成分，这一过程有可能因为没有吸取干净上清导致胞核中有胞质成的残留导致分离彻底。同时，第一步裂解过程也可能因为不同细胞的裂解时间不够或者裂解过度导致胞质/胞核的分离不纯，导致分离效率不高。有鉴于此，特提出本专利技术。
技术实现思路
本专利技术的主要目的在于提供一种用于改进细胞核/细胞质RNA分离效率的RNA提取方法，以至少缓解了现有技术中存在的技术问题之一。本专利技术提供了一种用于改进细胞核/细胞质RNA分离效率的RNA提取方法，所述提取方法包括：向细胞中加入胞膜裂解液后进行细胞计数，当死亡细胞占总细胞量的60-80％时停止裂解，将裂解产物进行核质分离并分别提取RNA。进一步的，加入裂解液后每3-5分钟进行一次细胞计数，至死亡细胞占总细胞量的60-80％。进一步的，通过台盼蓝染色法进行细胞计数。进一步的，将裂解产物通过过滤的方式，实现核质成分分离；优选地，将裂解产物通过超细玻璃纤维膜过滤。进一步的，将裂解产物加入含有硅胶膜或超细玻璃纤维过滤柱的离心管中进行过滤，实现核质成分分离。进一步的，过滤后还包括清洗的步骤。进一步的，通过离心的方式进行清洗；优选地，所述离心的条件为2500-3500g，离心8-12分钟，优选为3000g，离心10分钟。进一步的，分离后的细胞质的RNA提取方法包括酚-氯仿法或离心柱法。进一步的，分离后的细胞核的RNA提取方法包括先对细胞核进行裂解处理，再采用酚-氯仿法或离心柱法提取细胞核RNA。另外，本专利技术还提供了上述的提取方法在功能基因组学领域中的应用。与现有技术相比，本专利技术具有如下有益效果：本专利技术提供的细胞RNA的提取方法，在进行细胞裂解后进行细胞计数，当死亡细胞占总细胞量的60-80％时停止裂解，然后再进行后续的RNA提取操作。该方法通过统计死亡细胞数量占比，能够掌握细胞裂解程度，从而有效防止细胞裂解过度或裂解不足，避免细胞膜裂解过度导致核膜裂解，胞质RNA受到胞核RNA的污染的问题，或者由于裂解不足而使得提取到的胞质RNA的量低于实际细胞质中RNA的含量的问题，提高胞质/胞核的分离效率。附图说明为了更清楚地说明本专利技术具体实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对具体实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本专利技术的一些实施方式，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。图1为本专利技术实施例1提供的细胞RNA的提取方法的流程图；图2A为本专利技术实验例提供的QRT-PCR检测采用改进前方法提取的gapdh和U6反应核/质的分离比例的结果图；图2B为本专利技术实验例提供的QRT-PCR检测采用改进后方法提取的gapdh和U6反应核/质的分离比例的结果图。具体实施方式下面将结合实施例对本专利技术的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本专利技术一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本专利技术中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本专利技术保护的范围。除非本文另有定义，连同本专利技术使用的科学和技术术语应具有本领域普通技术人员通常理解的含义。术语的含义和范围应当清晰，然而，在任何潜在不明确性的情况下，本文提供的定义优先于任何字典或外来定义。在本申请中，除非另有说明，术语“包括”及其他形式的使用是非限制性的。一般地，连同本文描述的细胞和组织培养、分子生物学、免疫学、微生物学、遗传学以及蛋白和核酸化学和杂交使用的命名法和其技术是本领域众所周知和通常使用的那些。除非另有说明，本专利技术的方法和技术一般根据本领域众所周知，且如各种一般和更具体的参考文献中所述的常规方法来进行，所述参考文献在本说明书自始至终引用和讨论。酶促反应和纯化技术根据制造商的说明书、如本领域通常实现的或如本文所述来进行。连同本文描述的分析化学、合成有机化学以及医学和药物化学使用的命名法、以及其实验室程序和技术是本领域众所周知和通常使用的那些。根据本专利技术的一个方面，提供了一种细胞RNA的提取方法，所述提取方法包括：向细胞中加入胞膜裂解液后进行细胞计数，当死亡细胞占总细胞量的60-80％时停止裂解，将裂解产物进行核质分离并分别提取RNA。本专利技术提供的细胞RNA的提取方法，通过统计死亡细胞数量占比，能够掌握细胞裂解程度，从而有效防止细胞裂解过度或裂解不足，避免细胞膜裂解过度导致核膜裂解，胞质RNA受到胞核RNA的污染的问题，或者由于裂解不足而使得提取到的胞质RNA的量低于实际细胞质中RNA的含量的问题，提高胞质/胞核的分离效率。需要进行说明的是，本专利技术对胞膜裂解液的种类不做限定，现有市售产品中凡是能够起到裂解细胞膜作用的产品均为作为本专利技术中的胞膜裂解液。可选地，可以使用温和洗涤剂对细胞膜进行裂解，例如可以为，但不限于PBS或Hanks平衡盐溶液。当死亡细胞占总细胞量的60-80％，例如可以为，但不限于60％、65％、70％、75％本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种用于改进细胞核/细胞质RNA分离效率的RNA提取方法，其特征在于，所述提取方法包括：向细胞中加入胞膜裂解液后进行细胞计数，当死亡细胞占总细胞量的60-80％时停止裂解，将裂解产物进行核质分离并分别提取RNA。/n

【技术特征摘要】
1.一种用于改进细胞核/细胞质RNA分离效率的RNA提取方法，其特征在于，所述提取方法包括：向细胞中加入胞膜裂解液后进行细胞计数，当死亡细胞占总细胞量的60-80％时停止裂解，将裂解产物进行核质分离并分别提取RNA。


2.根据权利要求1所述的提取方法，其特征在于，加入裂解液后每3-5分钟进行一次细胞计数，至死亡细胞占总细胞量的60-80％。


3.根据权利要求1所述的提取方法，其特征在于，通过台盼蓝染色法进行细胞计数。


4.根据权利要求1所述的提取方法，其特征在于，将裂解产物通过过滤的方式，实现核质成分分离；
优选地，将裂解产物通过硅胶膜或超细玻璃纤维膜过滤。


5.根据权利要求4所述的提取方法，其特征在于，将裂解产物加入含有超细玻璃纤...

【专利技术属性】
技术研发人员：曾妮，
申请(专利权)人：曾妮，
类型：发明
国别省市：广东;44