一种单链环状DNA的制备方法技术

本发明专利技术属于核酸技术领域，涉及一种单链环状DNA的制备方法，通过PCR制备出其中一条链的5′端带有磷酸基团的中等长度的单磷酸化双链DNA，然后将环化反应所需的中等长度的单磷酸化双链DNA与辅助环化的模板DNA按照一定比例混合，加入耐热连接酶和反应缓冲液混合配制成连接反应体系，进行高温变性和降温连接的多次循环，制得只有一条链环化的双链产物；从中纯化分离出已环化的单链环状DNA，并进行电泳检测。该方法不需要制备单链DNA，直接以中等长度双链DNA为原料，采用双链变温循环连接反应高效制备中等长度单环DNA；酶法连接成环能够打开中等长度双链DNA复杂的二级结构，提高中等长度单链环状DNA的产率。

【技术实现步骤摘要】
一种单链环状DNA的制备方法
本专利技术属于核酸
，具体涉及一种单链环状DNA的制备方法。
技术介绍
单链环状DNA，是一种由单链DNA首尾相接形成的环状结构，具有稳定性和灵活性较强、无游离的末端、且不易被常见的核酸酶降解等特性，单链环状DNA逐渐成为构建DNA折纸和分子机器等高级纳米结构的重要元件。此外，单链环状DNA也可以应用于食品、生物、医药等领域；在分子生物学领域，单链环状DNA可用作滚环扩增、转录的模板；在检测领域，可将环状分子机器上设计上G-四聚体及DNAzyme，进行样品中离子等物质的检测；单链环状DNA有着重要的应用价值。目前，对单链环状DNA的研究多集中在小于100nt的小型单链环和数千nt的天然噬菌体分离出来的大型单链环的应用上。其中，Sleiman等人利用小单环DNA作为自组装基本元件制备纳米材料(NucleicAcidsResearch,2017,45(9):e74-e75)；Rothemund等利用M13mp18噬菌体DNA(天然存在的大型单链环状DNA，长度为6407nt)作为脚手架制备各种纳米材料。相较于小型单环DNA与大型单环DNA，中等长度单链环状DNA，即长度为100～1000nt的单链环状DNA具有柔韧性好、携带信息量大、易于观察等优点，且序列信息及长度可根据实验需要进行编辑，因此，中等长度单链环状DNA的制备对DNA纳米技术以及其他相关研究的发展具有重要意义。当前，常用的成环方法为恒温单链连接，但是恒温单链连接法制备中等长度单环DNA难度较大。首先，游离的中等长度单链DNA本身难以制备；其次，由于单链具有复杂的二级结构，在恒温连接过程中很难打开，甚至会存在单链两端自身配对的情况，导致与成环链两端互补的辅助模板DNA，即splint很难找到单链DNA模板的两端；第三，长于100nt的单链制备困难，成本高，而一般DNA扩增的产物是双链(如PCR技术等)。这些因素很大程度上增加了制备单环DNA的难度。因此，如果能提高中等长度单链环状DNA的产率并得到几乎无副产物的环状DNA或RNA，使其研究和应用大大简化，不但有助于对其拓扑结构的详细研究，也可为环状DNA纳米技术和医疗诊断等研究提供大量的研究材料。
技术实现思路
本专利技术针对传统中等长度单环DNA制备过程中，作为重要原料的中等长度单链DNA难以制备、且恒温连接难以打开单链复杂二级结构而导致连接效率较低的问题，提出了一种单链环状DNA的制备方法，以中等长度双链DNA为原料，采用双链变温循环连接反应高效制备中等长度单环DNA。该方法不需要制备中等长度单链DNA，并且在酶法连接成环过程中，能够打开中等长度双链DNA复杂的二级结构，提高中等长度单环DNA的产率。本专利技术的技术方案是：一种单链环状DNA的制备方法，包括以下步骤：步骤一，通过PCR制备出其中一条链的5′端带有磷酸基团的中等长度的单磷酸化双链DNA，并采用单链核酸外切酶切除PCR反应物；步骤一中双链DNA的制备方法为使用只有其中一条引物的5′端带有磷酸基团的一对引物进行PCR，PCR双链产物中只有以这条带有磷酸基团的引物生成的DNA链的末端带有磷酸基团；步骤二，将环化反应所需的中等长度的单磷酸化双链DNA与辅助环化的模板DNA(下统称splint)按照一定比例混合，然后加入耐热连接酶和反应缓冲液混合配制成连接反应体系，进行高温变性和降温连接的多次循环，稳定一段时间后缓慢降温至常温，制得只有一条链环化的双链产物；步骤三、从步骤二制备得到的产物中分离纯化出已环化好的单链环状DNA，并进行电泳检测。当对单链环状DNA的纯度要求很高时，需要纯化，纯化方法包括：用外切酶去除互补链DNA和未环化的成环链、酚-氯仿抽提除蛋白、乙醇沉淀浓缩、PAGE切胶回收或HPLC纯化。设计一种基于热循环的连接反应，即中等长度双链DNA在splint辅助下，进行高温变性和降温连接的多次循环，最后稳定一段时间后缓慢降温至常温，此方法称为中等长度单环的变温循环连接反应。该反应在高温下将游离中等长度的双链DNA二级结构打开，随后降至Splint结合和连接酶反应温度进行DNA连接，多次循环。值得注意的是，在连接过程中由于仅有双链中的一条链的5′端带有磷酸基团，故仅有5′端带磷酸基团的这条链也就是成环链能够发生连接，而互补链因不含有磷酸基团且没有与之相对应的Splint而不发生连接。这种升降温循环的连接方法可有效减小序列的复杂二级结构对连环的影响，以提高连接效率。进一步的，所述步骤二中环化反应所需的单磷酸化双链DNA包括一条用于成环的5′端带有磷酸基团的单链DNA，称为成环链，另一条单链DNA为成环链的互补链；所述splint为与成环链两端互补的短链DNA；所述步骤二中加入50-100nt长的同成环链的中间部分具有相同序列，即与互补链的中间部分互补的单链DNA，该单链DNA防止在升温降温时，双链快速复性，用于促进连接。进一步的，所述步骤一制备的单磷酸化双链DNA的长度为100-1000bp；优选的，所述单磷酸化双链DNA的长度为250-1000bp。进一步的，所述单磷酸化双链DNA与splint的摩尔浓度比为1:10-1:50。Splint过少时，多条DNA链共用一条splint，会促进大分子副产物的产生；splint过多时，一条成环链两端带有两条splint会影响连接的效率。具体的说，环化底物是双链，连接时涉及到splint与成环链的互补链一起竞争成环链的问题，因此splint浓度提高，能够提高splint的竞争力，从而使splint更好地与成环链杂交，进而辅助成环。进一步的，所述splint的长度为30～60nt。进一步的，所述步骤二中的升温降温循环次数为10～40。循环次数太多，容易增加副产物生成且浪费时间，循环数太少，不易获得较高成环率，因此循环次数控制在10～40。进一步的，所述步骤二中的连接温度为50～80℃。进一步的，所述耐热连接酶包括TaqDNAligase、Tba连接酶和9°NTMDNAligase；所述步骤二中的反应缓冲液的组成为耐热连接酶相应的反应缓冲液。进一步的，TaqDNAligase的反应缓冲液组成为20mMTris-HCl(pH7.6@25℃)，25mMPotassiumAcetate，10mMMagnesiumAcetate，1mMNAD+，10mMDTT，0.1％X-100；9°NTMDNAligase的反应缓冲液组成为10mMTris-HCl(pH7.5@25℃)，600μMATP，2.5mMdithiothreitol，2.5mMMgCl2，0.1％TritonX-100。本专利技术的有益效果：(1)本专利技术提供的一种单链环状DNA的制备方法，以中等长度双链DNA为原料，采用双链变温循环连接法高效制备中等长度单环DNA，该方法不需要制备中等长度单链DNA，原料易得，并且在酶法连接成环过程中，能够打开中等长度双链DNA复杂的二级结构，提高中等长度DNA单本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种单链环状DNA的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：/n步骤一，通过PCR制备出其中一条链的5′端带有磷酸基团的中等长度的单磷酸化双链DNA，并采用单链核酸外切酶切除PCR反应物；/n步骤二，将环化反应所需的中等长度的单磷酸化双链DNA与辅助环化的模板DNA(下统称splint)按照一定比例混合，然后加入耐热连接酶和反应缓冲液混合配制成连接反应体系，进行高温变性和降温连接的多次循环，稳定一段时间后缓慢降温至常温，制得只有一条链环化的双链产物；/n步骤三，从步骤二制备得到的产物中分离纯化出已环化的单链环状DNA，并进行电泳检测。/n

【技术特征摘要】
1.一种单链环状DNA的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
步骤一，通过PCR制备出其中一条链的5′端带有磷酸基团的中等长度的单磷酸化双链DNA，并采用单链核酸外切酶切除PCR反应物；
步骤二，将环化反应所需的中等长度的单磷酸化双链DNA与辅助环化的模板DNA(下统称splint)按照一定比例混合，然后加入耐热连接酶和反应缓冲液混合配制成连接反应体系，进行高温变性和降温连接的多次循环，稳定一段时间后缓慢降温至常温，制得只有一条链环化的双链产物；
步骤三，从步骤二制备得到的产物中分离纯化出已环化的单链环状DNA，并进行电泳检测。


2.根据权利要求1所述的单链环状DNA的制备方法，其特征在于，所述步骤二中环化反应所需的单磷酸化双链DNA包括一条用于成环的5′端带有磷酸基团的单链DNA，称为成环链，另一条单链DNA为成环链的互补链；所述splint为与成环链两端互补的短链DNA；所述步骤二中加入50-100nt长的同成环链的中间部分具有相同序列，即与互补链的中间部分互补的单链DNA。


3.根据权利要求1所述的单链环状DNA的制备方法，其特征在于，所述步骤一制备的单磷酸化双链DNA的长度为100-1000bp。


4.根据权利要求3所述的单链环状DNA的制备方法，其特征在于，所述单磷酸化双链DNA的长度为250-1000bp。


5.根据权...

【专利技术属性】
技术研发人员：梁兴国，刘梦琴，王伟男，隋哲，安然，
申请(专利权)人：中国海洋大学，
类型：发明
国别省市：山东;37